[發明專利]一種食管上皮干細胞的分離培養方法

有效

• 申請號: 201610019927.9
• 申請日: 2016-01-13
• 公開（公告）號: CN105505860B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 高社干;馮笑山;梁碩;牟紅梅;劉剛;原翔;馬志坤;孔金玉
• 申請（專利權）人: 河南科技大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 洛陽市凱旋專利事務所 41112
• 代理人: 韓曉靜

1.一種食管上皮干細胞的分離培養方法，其特征是：其包括以下步驟：

步驟1、取食管黏膜組織及附著的上皮，去除肌肉組織，取黏膜上皮組織的基底層并將其剪成碎片，將碎片加入含有0.1～0.3％膠原酶I型、0.1～0.3％鏈酶蛋白酶和0.5～1.0mg/ml脫氧核糖核酸酶I的Ham’s F12-DMEM 1/1溶液中，37℃恒溫消化2～4h，過濾后離心，即得細胞，將獲得的細胞鋪于包被有基質的培養瓶、培養板或培養皿中，包被在培養瓶、培養板或培養皿上的基質為膠原酶、牛血清白蛋白中的一種或兩種組合；

步驟2、加入添加有10～20mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸、2～5mmol/L碳酸氫鈉、2～5mmol/L L-谷氨酸、體積分數2～5％的胎牛血清、20～30ng/mL人表皮生長因子、3～6μg/mL胰島素、50～150μmol/L氫化可的松、0.05～0.2μg/mL霍亂弧菌毒素、4～6μg/mL轉鐵蛋白、20～40μg/mL牛垂體提取物、0.01～0.02μmol/L類維生素A、8～25μmol/L細胞信號通路抑制劑的DMEM/Ham’s F-12培養液；細胞信號通路抑制劑含有：濃度為5～10μM的ROCKi、濃度為1～5μM的TGF-β抑制劑A83-01、濃度為1～5μM的BMP抑制劑DMH1、濃度為1～5μM的GSK抑制劑CHIR99021；

步驟3、將含有細胞懸液的培養瓶、培養板或培養皿放入37℃孵箱中培養，2～3天可見到細胞貼壁，10～14天即可形成單層上皮干細胞。

2.根據權利要求1所述的食管上皮干細胞的分離培養方法，其特征是：其Ham’s F12-DMEM 1/1溶液中還含有10～20mg/ml牛血清蛋白。

3.根據權利要求1所述的食管上皮干細胞的分離培養方法，其特征是：其步驟1中，培養瓶、培養板或培養皿包被的方法為：加入含0.1～0.5mg/mL牛血清白蛋白和/或30～50μg/mL膠原酶Ⅰ的EBSS培養液，完全覆蓋培養瓶、培養板或培養皿底部即可，在37℃恒溫孵箱中孵育1～2小時，孵育完后吸棄培養液，用無菌PBS清洗3～5次。

4.一種食管上皮干細胞的分離培養液，其特征是：其為添加有10～20mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸、2～5mmol/L碳酸氫鈉、2～5mmol/L L-谷氨酸、體積分數2～5％的胎牛血清、20～30ng/mL人表皮生長因子、3～6μg/mL胰島素、50～150μmol/L氫化可的松、0.05～0.2μg/mL霍亂弧菌毒素、4～6μg/mL轉鐵蛋白、20～40μg/mL牛垂體提取物、0.01～0.02μmol/L類維生素A、8～25μmol/L細胞信號通路抑制劑的DMEM/Ham’s F-12培養液；細胞信號通路抑制劑含有：濃度為5～10μM的ROCKi、濃度為1～5μM的TGF-β抑制劑A83-01、濃度為1～5μM的BMP抑制劑DMH1、濃度為1～5μM的GSK抑制劑CHIR99021。