[發(fā)明專利]下調(diào)木質(zhì)素的白樺CCoAOMT基因及其編碼蛋白

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610019438.3
• 申請日: 2016-01-13
• 公開（公告）號: CN105624129A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉雪梅;尹偉平;劉闖
• 申請（專利權(quán)）人: 東北林業(yè)大學(xué);劉雪梅;尹偉平;劉闖
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及一個降低木質(zhì)素合成的白樺CCoAOMT基因及其編碼蛋白，屬于分子生 物學(xué)中的基因技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

木質(zhì)素為芳香族聚合物，是植物體中含量僅次于纖維素的一類高分子有機物質(zhì)，主要存 在于次生加厚的植物細(xì)胞壁中，可為植物提供機械支持，保護植物免受真菌入侵，近幾十年 的研究己闡明了木質(zhì)素單體的主要生物合成路線，并且通過木質(zhì)素調(diào)控能夠提高木本植物的 制漿率和草料的可消化性等。同時，植物也能適應(yīng)三種木質(zhì)素單體(H/G/S)間較大的比例變化。 參與木質(zhì)素生物合成途徑的酶有十多種，其中咖啡酞輔酶A-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)是木 質(zhì)素生物合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，主要催化羥基輔酶A酯的甲基化反應(yīng)，將咖啡酰輔酶A 轉(zhuǎn)化成阿魏酰輔酶A。該基因與G型木質(zhì)素和S型木質(zhì)素合成密切相關(guān)。相關(guān)文獻報道，抑 制CCoAOMT表達(dá)會使植物中木質(zhì)素含量普遍降低，且伴隨組分的改變，G和S木質(zhì)素同時 降低，G木質(zhì)素的下降幅度大于S木質(zhì)素，S/G比值增加，最終使植物中木質(zhì)素含量降低， 木材結(jié)構(gòu)疏松，有利于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。CCoAOMT近來才被證實與木質(zhì)化有關(guān)。Pakusch 等首先提出可能存在一種催化咖啡酰CoA(coenzymeA)甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶；Kuhnl等與 Pakusch等在歐芹和胡蘿卜的細(xì)胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)了該酶活性，由于其活性受真菌激活子誘導(dǎo)， 起初認(rèn)為與植物抗病有關(guān)。Schmitt等從歐芹中克隆了CCoAOMT的cDNA，但并未確定其功 能。Ye等在百日草中首次證實CCoAOMT參與木質(zhì)素的生物合成。Li和Osakabe首次從裸 子植物松樹中克隆了CCoAOMT基因，發(fā)現(xiàn)其對咖啡酞COA的活力是5-羥基阿魏酞COA的 3.2倍。目前，從擬南芥、水稻、煙草、玉米等植物中已經(jīng)獲取了CCoAOMT基因。Zhong 等^[19]獲得反義CCoAOMT表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草，Klason木質(zhì)素含量下降36％～47％。G-木質(zhì)素 比-S木質(zhì)素減少的幅度大，S/G比值增加。Meyermans等^[9]在抑制CCoAOMT表達(dá)的轉(zhuǎn)基因 楊樹中發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量降低12％，S/G比值增加11％。Zhong等^[19]將反義CCoAOMT轉(zhuǎn)入楊 樹，也發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量明顯下降，且結(jié)構(gòu)疏松利于脫木質(zhì)素。進一步證實了CCoAOMT的功 能。目前，對于白樺的CCoAOMT基因的功能尚不清楚，也沒有涉及白樺CCoAOMT基因序 列及其功能的相關(guān)專利報道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明提供一種從白樺中克隆白樺木質(zhì)素合成基因CCoAOMT的方法：

(1)先采用改良的CTAB法提取白樺次生木質(zhì)部RNA，用ThermoScriptTMRT-PCRSystem反 轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA第一鏈；

(2)設(shè)計用以擴增白樺CCoAOMT片段的簡并引物；引物序列為：正向引物：CCoAOMT-F： 5′-AGCGATGCYCTYTAYCAGTA-3′；反向引物：CCoAOMT-R：5′- TTCCABAGVGTGTTGTCGTA-3′

(3)利用RT-PCR和RACE方法獲得基因的全長cDNA，命名為白樺CCoAOMT；

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示；其編碼蛋白的氨基酸 序列如序列表SEQIDNO:2所示；

本發(fā)明構(gòu)建了白樺CCoAOMT基因的植物表達(dá)載體，構(gòu)建的植物表達(dá)載體(pBI121- CCoAOMT)經(jīng)農(nóng)桿菌浸染煙草植株，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株且植物莖部木質(zhì)素含量降低，表明 該基因具有降低煙草莖部木質(zhì)素含量的功能并且能夠調(diào)控木質(zhì)素單體組分的變化。

構(gòu)建白樺CCoAOMT基因植物表達(dá)載體的技術(shù)方案如下：

選擇pBI121載體作為基本植物表達(dá)載體，在pBI121上選擇XbaⅠ和BamHⅠ兩個酶切位 點，設(shè)計帶有酶切位點和保護堿基的白樺CCoAOMT引物，并克隆出白樺CCoAOMT基因 全長。雙酶切質(zhì)粒和白樺CCoAOMT基因，再用T4連接酶進行連接，檢測構(gòu)建的載體pBI121- CCoAOMT。