[發(fā)明專利]褐色橘蚜ABCG4基因及其dsRNA

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610019215.7
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105420251B
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王進(jìn)軍;尚峰;丁碧月;熊英;魏冬
• 申請（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務(wù)所(普通合伙) 50211
• 代理人: 郭云

本發(fā)明公開了一種褐色橘蚜ABCG4基因，其序列如SEQ ID NO:3所示；還公開了一種褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA，序列如SEQ ID NO:6所示；還公開了一種褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA的合成方法，包括如下步驟：提取褐色橘蚜的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA作為擴(kuò)增模板，以序列為SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后回收產(chǎn)物，以膠回收產(chǎn)物為模板合成得到褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA。本發(fā)明的ABCG4基因的dsRNA，基因沉默效率高，基因干擾后褐色橘蚜有明顯表型變化，在研發(fā)新型殺蟲劑方面有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及昆蟲的生長發(fā)育調(diào)控和基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種褐色橘蚜ABCG4基因及其dsRNA。

背景技術(shù)

褐色橘蚜(Toxoptera citricida)是一種世界性的柑橘害蟲，同時是柑橘衰退病病毒的主要傳播媒介，對柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，目前化學(xué)防治仍是控制褐色橘蚜的重要措施。化學(xué)農(nóng)藥施用不當(dāng)，不僅影響果品安全，同時還會導(dǎo)致嚴(yán)重的抗藥性。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默手段，是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA，Double-stranded RNA，雙鏈核糖核酸)誘發(fā)的、同源RNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是通過dsRNA的介導(dǎo)特異性的降解對應(yīng)序列的mRNA。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性抑制特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和基因治療領(lǐng)域。

ABCG4(ATP binding cassette transporter G4)是ABC轉(zhuǎn)運蛋白G亞家族4號基因，ABC轉(zhuǎn)運蛋白又稱腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白，是一類重要的跨膜蛋白超家族，其中大多數(shù)ABC轉(zhuǎn)運蛋白是初級主動運輸轉(zhuǎn)運體。ABC轉(zhuǎn)運蛋白需要ATP的結(jié)合與水解產(chǎn)生的能量將底物進(jìn)行跨膜運輸。ABC轉(zhuǎn)運蛋白輸送的分析包括糖類，脂質(zhì)，肽和氨基酸，重金屬離子及其共軛物，以及有毒的代謝產(chǎn)物和化學(xué)藥物，ABC轉(zhuǎn)運蛋白的生理功能在細(xì)菌和脊椎動物中已進(jìn)行了廣泛的研究，但是目前針對褐色橘蚜ABC轉(zhuǎn)運蛋白的相關(guān)研究較少，也未見針對褐色橘蚜ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的dsRNA的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種褐色橘蚜ABCG4基因及其dsRNA。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種褐色橘蚜ABCG4基因，其序列如SEQ ID NO:3所示。

一種褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA，其序列如SEQ ID NO:6所示。

一種褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA的合成方法，包括如下步驟：提取褐色橘蚜的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA作為擴(kuò)增模板，以序列為SEQ ID NO:4的上游引物和以序列為SEQ IDNO:5的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后回收產(chǎn)物，以膠回收產(chǎn)物為模板合成得到褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA。

在上述技術(shù)方案中，PCR擴(kuò)增時25μl的PCR反應(yīng)體系包括：濃度為800-1200ng/μl的cDNA模板0.5μl，濃度為0.15-0.25μM的上、下游引物各1μl，PrimeSTAR Max Premix 12.5μl以及去核酸酶水10μl。

在上述技術(shù)方案中，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s、60℃退火10s、72℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃條件下延伸10min。