[發(fā)明專利]一種用于長牡蠣親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610018599.0
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105441576B
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李琪;劉婷;于紅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686
• 代理公司: 青島海昊知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 孫洪葉

1.一種用于長牡蠣親子鑒定的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取長牡蠣親本和子代個體的DNA；

(2)長牡蠣多態(tài)性微衛(wèi)星引物的篩選：根據(jù)引物篩選軟件以及現(xiàn)有文獻記載的長牡蠣引物序列，合成引物，并通過對長牡蠣個體進行PCR擴增，篩選出擴增穩(wěn)定、特異性強的引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上帶有熒光標記；所述引物序列如下：

該引物序列包括18種正、反向引物以及1種帶有熒光標記的通用引物序列；

(3)對步驟(1)得到的長牡蠣親本和子代個體的DNA進行多重PCR擴增：對步驟(2)中篩選得到的引物進行組合，并通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件得到6組多重PCR組合；

所述的6組多重PCR組合如下：

(4)獲得長牡蠣親本和子代的基因型數(shù)據(jù)：對步驟(3)得到的多重PCR擴增產(chǎn)物進行熒光信號檢測，從而獲得親本和子代的基因型數(shù)據(jù)；

(5)通過基因序列分析軟件對上述得到的基因型數(shù)據(jù)進行分析對比，以對長牡蠣親本和子代進行親緣關(guān)系鑒定。

2.如權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于，所述正向引物的5’端添加M13(-21)通用引物序列，熒光標記添加在M13(-21)通用引物序列的5’端。

3.如權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于，上述步驟(3)中的多重PCR擴增的反應(yīng)程序分為兩步：前35個循環(huán)使用50℃～60℃的退火溫度，后8個循環(huán)使用53℃的退火溫度。

4.如權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于，上述步驟(3)中的引物組合和優(yōu)化PCR條件具體操作為：首先將所述各引物兩兩組合，選出擴增清晰的組合再進行3個位點的多重PCR體系的構(gòu)建；通過優(yōu)化退火溫度、引物濃度、反應(yīng)體系最終得出6組多重PCR組合。

5.如權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于，上述步驟(4)中熒光信號檢測采用毛細管熒光電泳方法。

6.如權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于，所述的基因序列分析軟件為Genemapper v4.0和Cervus 3.0。

7.如權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星多重PCR方法，其特征在于，所述的長牡蠣子代DNA提取選取的實驗材料是D形幼蟲。