[發(fā)明專利]一種菊粉內(nèi)切酶的制備方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610017792.2
• 申請(qǐng)日: 2016-01-12
• 公開（公告）號(hào): CN105505899A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜岷;王培培;戴仲雪;馬江鋒;吳昊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/24
• 分類號(hào): C12N9/24;C12N15/70
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種經(jīng)基因工程技術(shù)優(yōu)化后的菊粉 內(nèi)切酶基因經(jīng)重組大腸桿菌表達(dá)后高效制備菊粉內(nèi)切酶的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

菊粉是由β-2,1-糖苷鍵連接D-呋喃果糖分子組成的線性直鏈多糖，末端常帶有一個(gè)葡萄糖， 聚合度DP通常為2～60之間，通常存在于菊苣，菊芋及雪蓮果等植物的根狀塊莖中。菊粉酶 是能夠水解β-2,1-D-果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶類，學(xué)名β-2,1-D果聚糖水解酶(EC3.2.1)， 又稱β-果聚糖酶，2,1-D-果聚糖水解酶。微生物菊粉酶可以催化植物中的菊糖水解為果糖或低 聚果糖。根據(jù)其對(duì)底物的作用方式不同，菊粉酶分為兩類。一類是外切果聚糖水解酶(EC 3.2.1.8)，又稱外切菊粉酶，外切菊粉酶從菊糖或低聚果糖分子的非還原末端依次水解β-D果 糖苷鍵，生成一分子果糖和少一個(gè)果糖分子的果聚糖，最終產(chǎn)物為果糖和葡萄糖。另一類是內(nèi) 切果聚糖水解酶(EC3.2.1.7)，又稱內(nèi)切菊粉酶。內(nèi)切菊粉酶從菊糖分子內(nèi)部隨機(jī)切斷β-2,1- 呋喃果糖苷鍵，得到GF₂、GF₃、GF₄、F₂、F₃、F₄、F₅等低聚果糖和短鏈果聚糖。內(nèi)切菊粉酶 在工業(yè)領(lǐng)域用于生產(chǎn)低聚果糖有很大的潛力。

應(yīng)用內(nèi)切菊粉酶這一催化特性，內(nèi)切菊粉酶能以菊粉為底物，催化菊粉水解成低聚果糖。 低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，具有重要的健康、藥用開發(fā)價(jià)值。制備適 合工業(yè)化生產(chǎn)的內(nèi)切菊粉酶是生產(chǎn)低聚果糖技術(shù)的關(guān)鍵。

菊粉內(nèi)切酶主要分布在微生物中，目前研究較多的產(chǎn)菊粉酶的微生物包括真菌、酵母和細(xì) 菌。其中絲狀真菌有17個(gè)屬40余種，酵母菌有10個(gè)屬20余種，細(xì)菌有12個(gè)屬10余種。研 究較多的產(chǎn)菊粉酶絲狀真菌主要包括Aspergillusniger、Penicilliumsp、Rhizopusdelemar、 Fusariumoxysporum、Talaromycesflavusvarflavus和Chrysosporiumpannorum等，其菊粉酶多 為胞外酶；酵母主要有Kluyveromycesfragilis、Kluyveromycesmarxianus、Debaryomyces cantarellii和Saccharomycesfragilis等，其菊粉酶多為胞內(nèi)酶或與細(xì)胞壁相結(jié)合；細(xì)菌主要有 Bacillussubtilis、Athrobactersp.、Pseudomonassp.和Xanthomonassp.等，其菊粉酶以胞外酶為 主。研究表明，大部分微生物分泌的菊粉酶主要為外切酶，或內(nèi)外切混合酶。鑒于直接從野生 菌中提取內(nèi)切菊粉酶存在工藝復(fù)雜，提取率低且較難將內(nèi)外切菊粉酶分開及成本昂貴等問題， 尋找廉價(jià)、高效的外源基因表達(dá)方法是目前內(nèi)切菊粉酶的研究熱點(diǎn)。

無花果曲霉(AspergillusficuumATCC16882)具有編碼內(nèi)切菊粉酶的基因endo-inu2。本 發(fā)明以AspergillusficuumATCC16882的endo-inu2基因?yàn)閬碓葱蛄校ㄟ^基因工程技術(shù)對(duì)基因 序列進(jìn)行優(yōu)化，選用大腸桿菌作為宿主，構(gòu)建此具有內(nèi)切菊粉酶活性的重組大腸桿菌。大腸桿 菌遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、易于操作，是表達(dá)外源蛋白的首選體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效制備菊粉內(nèi)切酶的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種菊粉內(nèi)切酶的制備方法，該制備方法包括如下步驟：

步驟一，構(gòu)建大腸桿菌工程菌：將經(jīng)過基因工程技術(shù)優(yōu)化后的編碼菊粉內(nèi)切酶的基因序 列pelB-NSinu2，插入到大腸桿菌pET28a載體上，構(gòu)建出pET28a-pelB-NSinu2質(zhì)粒，導(dǎo)入大 腸桿菌EscherichiacoliBL21中，構(gòu)建出高效分泌表達(dá)菊粉內(nèi)切酶的重組大腸桿菌E.coliBL21 pET28a-pelB-NSinu2；

步驟二，利用步驟一獲得的大腸桿菌工程菌進(jìn)行發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)菊粉內(nèi)切酶的分泌表達(dá)；

步驟三，提取發(fā)酵上清液，對(duì)該上清液進(jìn)行純化得到菊粉內(nèi)切酶液。

進(jìn)一步地，步驟一所述的構(gòu)建大腸桿菌工程菌的具體步驟如下：