[發明專利]鰩血管生成抑制因子1功能區變體JG50及其應用

有效

• 申請號: 201610017406.X
• 申請日: 2014-06-06
• 公開（公告）號: CN105481963B
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發明（設計）人: 張壘;張勇
• 申請（專利權）人: 陳斯澤;廣東藥科大學附屬第一醫院
• 主分類號: C07K14/46
• 分類號: C07K14/46;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 佛山卓就專利代理事務所(普通合伙) 44490
• 代理人: 趙勇

本發明公開了一種鰩血管生成抑制因子1功能區蛋白及其變體，及其在制備抑制腫瘤生長的藥物中的應用。使本發明的蛋白變體通過真核表達，能夠相對于原始蛋白顯著的提高癌細胞的抑制效果。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及鰩血管生成抑制因子1功能區變體。

背景技術

鰩血管生成抑制因子1功能區以下簡稱鰩功能區，鰩血管生成抑制因子1是從南海海域一種鰩組織中分離出來的蛋白質(分子量42KD)。研究結果顯示：鰩血管生成抑制因子1顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌細胞誘導的雞胚絨毛尿囊膜血管生成；無論是腹腔注射還是灌胃都顯著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生長和轉移，減少腫瘤組織微血管密度，下調促血管生成因子VEGF的表達；對裸小鼠黑色素瘤B16細胞的轉移也有強抑制作用；下調促轉移因子CD44v6和ErBb2的表達；與5-氟尿嘧啶(5-FU)聯合應用時效果更顯著。鰩血管生成抑制因子1的作用靶點與美國基因技術研究所開發出的抗癌新藥Avastin不同。Avastin是基因工程產品，是VEGF的抗體，其作用靶點是VEGF；鰩血管生成抑制因子1是天然產物，它不僅作用于VEGF，還作用于bFGF和PDGF。

在現有技術中，為了提高蛋白的活性，針對蛋白的特異位點進行特異性的突變和取代，從而尋找活性更高的變體是常規的做法。為了進一步提高該蛋白的生物活性，申請人通過大量的實驗，針對鰩血管生成抑制因子1功能區氨基酸序列中特定的位點進行了點突變，從而獲得了比鰩血管生成抑制因子1功能區本身具有更高抑制活性的變體。

發明內容

本發明涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個對應于SEQ ID NO:1的功能區的位置9R、17F、42H、57S、62R、71K、80N、89P、100G、101R、129A、134E、151Q、163P、189K或217R的位置包含修飾。具體而言，本發明的變體具有改善的抑制活性。

優選地，應用于本發明的方法、呈現改善的抑制活性的蛋白變體為以下任一修飾：9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R或217R/ T。

本發明還涉及產生本發明的蛋白變體的方法，包括(a)培養宿主細胞；和(b)回收所述蛋白變體。

在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。

所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。

本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden編,VCH Publishers,New York,1989)。

本發明的多肽用于制備相應的藥物，去用于抑制癌癥。

具體實施方式

實施例1