[發(fā)明專(zhuān)利]鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)變體JG36及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610017401.7
• 申請(qǐng)日: 2014-06-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105541984A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張壘;張勇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 張勇
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/46
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/46;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)變 體。

背景技術(shù)

鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)以下簡(jiǎn)稱(chēng)鰩功能區(qū)，鰩血管生成抑制因子1是從南海 海域一種鰩組織中分離出來(lái)的蛋白質(zhì)(分子量42KD)。研究結(jié)果顯示：鰩血管生成抑制因子1 顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌細(xì)胞誘導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜血管生成；無(wú)論是 腹腔注射還是灌胃都顯著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，減少腫瘤組織微血管密度， 下調(diào)促血管生成因子VEGF的表達(dá)；對(duì)裸小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也有強(qiáng)抑制作用；下調(diào) 促轉(zhuǎn)移因子CD44v6和ErBb2的表達(dá)；與5-氟尿嘧啶(5-FU)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果更顯著。鰩血管生 成抑制因子1的作用靶點(diǎn)與美國(guó)基因技術(shù)研究所開(kāi)發(fā)出的抗癌新藥Avastin不同。Avastin 是基因工程產(chǎn)品，是VEGF的抗體，其作用靶點(diǎn)是VEGF；鰩血管生成抑制因子1是天然產(chǎn)物，它 不僅作用于VEGF，還作用于bFGF和PDGF。

在現(xiàn)有技術(shù)中，為了提高蛋白的活性，針對(duì)蛋白的特異位點(diǎn)進(jìn)行特異性的突變和 取代，從而尋找活性更高的變體是常規(guī)的做法。為了進(jìn)一步提高該蛋白的生物活性，申請(qǐng)人 通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，針對(duì)鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)氨基酸序列中特定的位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突 變，從而獲得了比鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)本身具有更高抑制活性的變體。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的功能區(qū) 的位置9R、17F、42H、57S、62R、71K、80N、89P、100G、101R、129A、134E、151Q、163P、189K或217R 的位置包含修飾。具體而言，本發(fā)明的變體具有改善的抑制活性。

優(yōu)選地，應(yīng)用于本發(fā)明的方法、呈現(xiàn)改善的抑制活性的蛋白變體為以下任一修飾： 9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、 151Q/N、163P/K、189K/R或217R/T。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白變體的方法，包括(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收 所述蛋白變體。

在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培 養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下 進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料 分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所 述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù) 公開(kāi)的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細(xì)胞裂解物 (lysate)回收。

所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng) 培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。

本發(fā)明的多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析 (例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型 (preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見(jiàn)，例如， ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden編,VCHPublishers,NewYork,1989)。

本發(fā)明的多肽用于制備相應(yīng)的藥物，去用于抑制癌癥。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.鰩血管生成抑制因子1功能區(qū)的獲得

鰩功能區(qū)由下列氨基酸殘基按下列順序組成：