[發(fā)明專利]GFP-Addnd3’UTR重組表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610016901.9
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN106591362A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李創(chuàng)舉;楊曉鴿;危起偉;岳華梅;葉歡
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N15/66;C12N15/89;C12N15/12;C07K14/46
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及GFP-Addnd 3’UTR重組表達(dá)載體，及其構(gòu)建方法，以及在標(biāo)記達(dá)氏鱘原始生殖細(xì)胞中的應(yīng)用，具體涉及一種從達(dá)氏鱘(Acipenser dabryanus)中分離、克隆得到一個生殖細(xì)胞特異的基因dead end(dnd)，利用該基因的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)融合綠色熒光表達(dá)蛋白，能有效標(biāo)記達(dá)氏鱘原始生殖細(xì)胞，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

行兩性生殖的多細(xì)胞動物均具有兩大細(xì)胞系：體細(xì)胞系和生殖細(xì)胞系(種質(zhì)系)。體細(xì)胞系維持生物個體的生長發(fā)育；生殖細(xì)胞系則通過產(chǎn)生兩性配子以維持物種的遺傳信息代代相傳。生殖細(xì)胞系起源于原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)，在魚類和許多其他動物中，PGCs在胚胎發(fā)育早期便與體細(xì)胞系發(fā)生分離(Wylie等，1999)。隨后，PGCs經(jīng)過遷移進(jìn)入性原基，分化成為精原細(xì)胞和卵原細(xì)胞最終產(chǎn)生成熟的兩性配子——精子和卵子。從PGCs的形成，遷移到配子的發(fā)生，生殖細(xì)胞發(fā)育的每個階段發(fā)生變化都可能給生物個體的生殖能力或育性帶來影響。生殖細(xì)胞所蘊含的生物學(xué)意義已使其日益成為科學(xué)研究的熱點(Xu Hongyan等，2010)。在斑馬魚和青鳉等模式生物的研究中發(fā)現(xiàn)，多個基因參與生殖細(xì)胞的形成和遷移等早期發(fā)育過程。得益于對這些基因的研究，生殖細(xì)胞已能被準(zhǔn)確地標(biāo)記并分離，進(jìn)行體外培養(yǎng)和移植，為瀕危物種種質(zhì)資源的冷凍保存及借助近緣物種進(jìn)行繁殖奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

Dead end(dnd)基因編碼一種RNA結(jié)合蛋白，對脊椎動物原始生殖細(xì)胞的遷移和配子發(fā)生至關(guān)重要。dnd首先在斑馬魚中被分離鑒定出來，是生殖質(zhì)特有的組分之一，在生殖細(xì)胞系中特異表達(dá)(Weidinger等，2003)。Dnd具有保守的RRM結(jié)構(gòu)域(RNA recognition motif)，是主要的功能結(jié)構(gòu)域。研究表明，dnd對生殖細(xì)胞的發(fā)生發(fā)育至關(guān)重要。敲降斑馬魚dnd基因能使PGCs的遷移發(fā)生異常，并最終凋亡。在對小鼠的研究中表明，dnd基因發(fā)生突變時，將導(dǎo)致PGCs缺失(Youngren等，2005)；抑制非洲爪蟾蜍dnd基因的表達(dá)，將引起其胚胎發(fā)育過程中PGCs不能正常遷移并最終消失(Horvay等，2006)；dnd基因在雞胚胎早期PGCs中特異表達(dá)，并能追蹤PGCs的遷移(Aramaki等，2007)。隨后，相繼在泥鰍、金魚、大西洋鮭、大菱鲆等魚類獲得了dnd基因的同源基因，并對其進(jìn)行了研究(Fujimoto等，2010；Goto等，2012；Nagasawa等2013；Lin Fan等，2013)。

基于基因表達(dá)特異性及功能，通過RNA定點表達(dá)技術(shù)(Localized RNA expression，LRE)如將生殖細(xì)胞特異基因vasa和nanos的3’UTR序列融合熒光表達(dá)蛋白，人工合成mRNA注射到早期胚胎中，能特異性地定位PGCs。PGCs在胚胎時期的可視化，為研究PGCs早期發(fā)育提供了有效工具。有研究表明，斑馬魚的nanos也可以有效地標(biāo)記其他物種的PGCs。然而由于物種的特異性，PGCs發(fā)生和遷移機(jī)制在不同物種中有所不同，研究本物種PGCs特異的標(biāo)記基因?qū)⒆兊酶鼮橹庇^有效。

達(dá)氏鱘(Acipenser dabryanus)隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)、鱘科(Acipenseridae)、鱘屬(Acipenser)，為我國的特有種，僅分布在長江流域，屬于國家一級保護(hù)動物。20世紀(jì)70年代初，達(dá)氏鱘的資源量比較豐富，曾占合江總產(chǎn)量的4％～10％。此后，由于過度捕撈、水電工程建設(shè)等人類活動的影響，達(dá)氏鱘的自然資源量銳減。盡管多家研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)實現(xiàn)達(dá)氏鱘的全人工繁殖，但是有很多問題亟待解決，且規(guī)模也比較有限。因此，研究達(dá)氏鱘PGCs早期發(fā)育，對探索保護(hù)達(dá)氏鱘的新途徑十分重要。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于提供一種標(biāo)記達(dá)氏鱘原始生殖細(xì)胞的方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種GFP-Addnd 3’UTR重組表達(dá)載體，其載體為表達(dá)載體pCS²⁺，其上連接有達(dá)氏鱘dnd基因的3’UTR片段和綠色熒光蛋白編碼區(qū)基因；所述達(dá)氏鱘dnd基因的3’UTR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述綠色熒光蛋白編碼區(qū)基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示(為公知的序列)。

所述GFP-Addnd 3’UTR重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：