[發明專利]一種禽流感病毒檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201610016877.9
• 申請日: 2016-01-11
• 公開（公告）號: CN105548541B
• 公開（公告）日: 2017-11-07
• 發明（設計）人: 王好玉;白雪;賈莉
• 申請（專利權）人: 王好玉
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 常州市華信天成專利代理事務所(普通合伙)32294
• 代理人: 何學成

技術領域

本發明涉及醫學檢測技術領域，具體是涉及一種禽流感病毒檢測試劑盒。

背景技術

禽流感是由禽流感病毒引起的一種禽類急性傳染病，同時某些亞型禽流感病毒也能感染人類。禽流感病毒根據其表面糖蛋白血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的抗原關系差異，可將其分為16種HA亞型和9種NA亞型。根據其致病性可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感，高致病性禽流感包括H5和H7亞型。特別是近年來頻繁爆發的H5亞型禽流感疫情給許多國家和地區的養禽業帶造成了巨大的經濟損失。

目前，檢測禽流感病毒的方法主要有：熒光定量PCR檢測病毒核酸、ELISA方法檢測病毒顆粒或者抗病毒抗體、膠體金檢測試劑、血凝抑制(HI)試驗檢測抗血凝素(HA)抗體、瓊脂免疫擴散(AGP)試驗檢測抗核蛋白的抗體、病毒中和、補體結合、神經氨酸酶抑制和單輻射溶血等方法。每種方法都有一定的缺陷，如熒光定量PCR檢測技術雖然最靈敏，但成本高，操作要求復雜，不容易推廣。膠體金檢測試劑存在敏感度低等缺點。AGP、HI和病毒中和等結果準確，但都需要制備純化、濃縮完整的病毒作為檢測抗原，而禽流感病毒是高致病性病毒，需在P3實驗室完成(生物安全防護三級實驗室)，不易生產、純化、成本較高，且存在感染性和容易散毒，在應用中存在很大的局限性。此外機體感染禽流感病毒，第10天后開始出現保護性抗體，檢測抗體不能達到早期檢出病毒的目的。

因此，需要制備出一種制備簡單，檢測速度快，檢測靈敏度高的禽流感檢測試劑盒。

發明內容

本發明解決的技術問題是提供一種禽流感病毒檢測試劑盒，能夠簡單快速檢測出禽流感病毒。

本發明的技術方案是：一種禽流感病毒檢測試劑盒，包括禽流感病毒囊膜抗原、納米金標記兔抗雞IgY抗體的檢測探針、斑點金免疫集中滲濾裝置，所述的集中滲濾裝置由塑料小盒、點加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜和吸水墊三部分組成，所述塑料小盒的盒蓋中央有邊長約0.6～1.0cm的正方形孔，盒底部有一位置與盒蓋上的方孔對應的方形凹槽，大小與盒蓋上的方孔一樣大；吸水墊放置于盒的凹槽處，硝酸纖維素膜放在吸水墊與盒蓋之間，吸水墊的面積比硝酸纖維素膜小1/3到1/2。

所述點加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纖維素膜采用如下方法制備得到：

(1)禽流感病毒培養：將禽流感病毒接種于10～12日齡的雞胚尿囊腔中，用石蠟封存后37℃孵育繁殖40h，再將雞胚置于0℃環境中10h，待紅血球凝固，取出，收獲尿囊液，即得到禽流感病毒；

(2)抗原提取與分離：將所得到的禽流感病毒溶于PBS緩沖液中，38～40℃，保溫20min，再按1:1的體積比加入弗氏佐劑，超聲處理10min，超聲頻率為12.8～24.6MHz；再用DEAE-葡聚糖凝膠作為交換劑，采用離子交換法進行分離，得到禽流感病毒囊膜抗原；

(3)抗原濃縮：將步驟(2)制備的禽流感病毒囊膜抗原冷卻成固體，緩慢溶解，不含抗原的純冰晶浮于液面，抗原則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，再次用稀釋液調節濃度至1.23～1.35μg/mL，即得抗原濃縮液，-10～-5℃保存；

(4)抗原包被硝酸纖維素膜：將硝酸纖維素膜上放入調節好濃度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，靜置40～60min，待硝酸纖維素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-15～-5℃低溫保存。

進一步地，所述的禽流感病毒囊膜抗原濃度為1.75～1.85μg/mL。

進一步地，所述的用于浸泡檢測探針的納米金標記兔抗雞IgY抗體的濃度為0.82～0.86μg/mL。

進一步地，所述的納米金標記兔抗雞IgY抗體的檢測探針的制備方法為：先用王水浸泡容器，再經超純水沖洗，烘干，加入氯金酸溶液，加熱至沸騰，迅速加入還原劑，繼續攪拌加熱至形成酒紅色溶液，攪拌冷卻，得到納米金溶液；將納米金溶液用碳酸鉀溶液調節其pH至8.0，將兔抗雞IgY抗體稀釋至0.80～0.90mg/ml，15000rpm、4℃條件下離心30min，得上清液，迅速滴加到納米金溶液中，攪拌均勻，再按10:1的體積比加入聚乙二醇20000，再按1:1的體積比加入封閉液，室溫繼續孵育30～35min，15000rpm，4℃條件下離心30min，去除上清液，稀釋液重懸沉淀并洗滌一次，得到納米金標記兔抗雞IgY抗體的檢測探針。

更進一步地，所述的還原劑為檸檬酸和檸檬酸鈉的按1:9的混合液。