[發明專利]基于一種新gRNA序列的CRISPR-Cas9系統在制備乙肝治療藥物中的應用

在審

• 申請號: 201610016280.4
• 申請日: 2016-01-11
• 公開（公告）號: CN105647922A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 宋宏彬;邱少富;李浩;劉鴻博;生春雨;李鵬;戚麗華;王立貴;謝靖;賈雷立;郝榮章;蘇文莉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;A61K48/00;A61K31/713;A61P1/16;A61P31/20
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

技術領域

本發明涉及一種gRNA序列及通過CRISPR-Cas9系統對乙肝病毒進行基因編輯的技 術，屬于基因突變和基因工程技術領域。

背景技術

乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)引起的嚴重傳染性疾 病。全球共有20億人感染過乙肝病毒，其中約4億人為乙肝病毒慢性感染者，HBV持續感染會 導致其中部分患者惡化為肝硬化甚至肝癌，每年死于HBV引起的肝臟相關疾病的人數達到 一百萬人。我國是乙肝大國，現有HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬 例。每年用于乙肝治療的直接費用超過1000億元，乙肝病毒感染已經成為危害公眾健康的 重大問題。雖然目前乙肝疫苗已廣泛應用，在一定程度上預防了HBV新發感染，降低了乙肝 發病率。但對于慢性HBV感染者，仍需通過有效的抗病毒治療來緩解病情、延緩或阻斷肝硬 化進程、防止出現肝衰竭或肝細胞癌變等嚴重后果。目前，常用的乙肝抗病毒治療藥物有干 擾素和核苷類似物等。干擾素(Interferon,IFN)具有直接的抗病毒和免疫調節作用并可有 效提高機體免疫力，但干擾素治療有嚴格的適應證和禁忌證，適于干擾素的患者僅1/3獲得 持續應答，而且副作用較多。核苷類似物(NucleostideAnalogues，NAs)可通過抑制DNA逆 轉錄酶活性從而抑制乙肝病毒的復制，然而，乙肝患者在口服NAs抗病毒治療過程中會出現 諸多問題:療程難以確定，大多數患者需要長期治療甚至終身治療，而隨著治療時間的延 長，產生HBV耐藥性突變的風險也隨之增加。重要的是，肝細胞內共價閉合環狀DNA(cccDNA) 的持續存在是HBV慢性感染和復發的根源。此外，HBV在復制過程中還能夠與細胞基因組進 行整合，而這種整合改變了內源性基因的功能或者染色體不穩定，從而誘導肝細胞癌的發 生。長期以來，一直未能找到以cccDNA和整合的HBVDNA為靶點的藥物或其他治療方法。NAs 雖然能明顯抑制病毒復制水平，使病毒DNA含量下降或消失，但由于肝細胞核內產生新病毒 的根源(病毒復制模板cccDNA)未能根除，即使患者在達到治療終點后停藥，殘存的病毒也 可能以cccDNA為模板再次大量復制，激發強烈的免疫應答，導致短期內廣泛肝組織損傷，病 情復發，嚴重者可以導致重型肝炎或肝衰竭。

近年來出現的DNA編輯技術可以對任何物種進行DNA的精確編輯，使得從根本上清 除cccDNA和整合的HBVDNA成為了可能。目前主要的基因編輯技術包括：鋅指核酸酶(Zinc Fingernucleases，ZFNs)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TranseriptionAetivator-like EffectorNueleases，TALENs)和成簇的規律間隔的短回文重復序列(Clustered RegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)/Cas9系統。ThomasJ Cradick等構建了針對HBVC基因的ZFNs系統，并使得HBV前基因組RNA(pgRNA)降低了約 29％，BloomK等利用TALENs有效干擾相應的HBV靶序列并抑制了病毒的復制，在 HepG2.2.15中，經過3次轉染，導致約35％的cccDNA發生突變，在水動力法轉染HBV小鼠模型 體內也顯著抑制了病毒復制。然而ZFNs和TALENs系統組裝與篩選復雜，存在細胞毒性、易脫 靶、構建成本偏高等問題，加之TALENs可能引起的免疫反應限制了其應用和發展。CRISPR- Cas9技術的出現有望克服上述不足，實現從根本上破壞或清除HBV的目標。