[發明專利]一種組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法

在審

• 申請號: 201610015895.5
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105536056A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 沈志森;竺亞斌;王劍;韋茜茜;陸達鍇
• 申請（專利權）人: 寧波市醫療中心李惠利醫院
• 主分類號: A61L27/18
• 分類號: A61L27/18;A61L27/22;A61L27/38;A61L27/58;C08J5/18;C08L87/00
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 蔡菡華

技術領域

本發明涉及生物醫學工程中的組織工程學領域，尤其涉及一種組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法。

背景技術

下咽癌是上消化道和上呼吸道最致命的腫瘤之一，臨床統計5年生存率在25%～40%，目前臨床上采用以手術為主結合放、化療的綜合治療方法。對于早期患者切除病灶后可以直接關閉咽腔，而對于中晚期患者因切除面積大，常需要依靠組織移植重建來改善咽喉部功能。傳統的可移植組織為來自患者自體的游離空腸、結腸、胸大肌皮瓣、前臂皮瓣等，此類移植不僅來源有限、對血管吻合要求高，而且造成了醫源性損傷，容易引起術后并發咽漏、感染等問題。

隨著組織工程學的興起，使用人工下咽瓣膜應用于咽喉部功能重建成為可能。人工下咽瓣膜由于可經體外培養、瓣膜大小不受限制等優點，可用于彌補傳統修補手術的不足。醫用聚氨酯因其良好的力學強度和彈性，以及良好的生物相容性，被認為是一種較好的生物材料，曾被研究用于體內軟組織瓣膜的替代物。但是這類人工瓣膜在使用后發現其降解速度太慢，或者幾乎不降解，移植到患者的咽喉部后，隨著新生組織的再生此人工瓣膜不能同步降解，反而成為異物存在于下咽部，阻礙新生瓣膜生長的同時，還會產生免疫排斥、炎癥等不良反應。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種力學性能好、降解速度適中、符合人體機能需求的組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種組織工程化的人工下咽瓣膜的制備方法，包括以下具體步驟：

（1）、將己二胺溶于正丙醇中得到濃度為0.01～0.10g/ml的己二胺/正丙醇溶液，將絲素蛋白溶于水中得到濃度為1～10g/L的絲素蛋白水溶液，備用；

（2）、取5～10g聚乙二醇、4.5～10gε-己內酯，以及占兩者總質量0.1～1.0%的乙酰丙酮鐵，置于干燥的三口燒瓶中，在干燥的氮氣保護下，在120～140℃的溫度下反應18～40h，得到聚己內酯—聚乙二醇—聚己內酯三嵌段共聚物，即預聚物；

（3）、在反應瓶中將4～10g上述預聚物溶于43～105g的1，4-二氧六環中，在干燥氮氣的保護下，在上述反應瓶中加入0.9～2.8g的六亞甲基二異氰酸酯形成溶液體系，向此溶液體系中加入占預聚物質量0.1～1.0%的乙酰丙酮鐵，升溫至70℃，反應1～3h后停止加熱，待體系的溫度降至室溫，再往此體系中加入含0.13～0.34g三羥甲基丙烷的5毫升1，4-二氧六環溶液，反應5～10h，移出反應瓶，在室溫下成膜，得到可生物降解的交聯型聚己內酯—聚乙二醇—聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜；

（4）、取上述平面膜，用體積分數為75%的醫用酒精浸洗15～30min，室溫晾干，然后將此平面膜浸入步驟（1）準備好的己二胺/正丙醇溶液中，在35℃的溫度下浸泡1～2min，取出后用去離子水浸洗3次，每次5～10min，再將平面膜在質量濃度為0.5～2%的戊二醛水溶液中浸泡3～6h，取出后用去離子水浸洗3次，每次5～10min，最后將平面膜浸入步驟（1）準備好的絲素蛋白水溶液中，在4℃的溫度下反應12～24h，取出后用去離子水浸洗3次，每次5～10min，37℃下真空烘干，得到表面接枝絲素蛋白的交聯型聚己內酯—聚乙二醇—聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜；

（5）、取離體的下咽組織，用含有青霉素和鏈霉素的無菌PBS混合液沖洗，其中青霉素在PBS混合液中的濃度為1000U/mL，鏈霉素在PBS混合液中的濃度為1mg/mL，然后將下咽組織在體積分數為75%的醫用酒精中浸洗5～10s，取出后用上述PBS混合液沖洗，再將下咽組織浸在1000ppm的次氯酸鈉中1～2min，取出后用上述PBS混合液沖洗，然后將下咽組織切成1～3mm³的組織小塊貼附于培養皿中，放置30min后，往培養皿中加入含有胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養基并淹沒下咽組織小塊，其中：胎牛血清在DMEM培養基中的體積分數為10%、青霉素的濃度為100U/mL、鏈霉素的濃度為100mg/L，1天后更換上述DMEM培養基，之后每隔2天更換DMEM培養基，約一周后在下咽組織小塊的周圍長出下咽成纖維細胞，待下咽成纖維細胞長至40～60%時棄去下咽組織塊，繼續培養下咽成纖維細胞至80%，傳代，取傳至3～5代的原代下咽成纖維細胞種植于步驟（4）所制得的絲素蛋白接枝的交聯型聚己內酯—聚乙二醇—聚六亞甲氨基甲酸酯平面膜上，懸液濃度為5×10⁴/毫升，得到組織工程化的人工下咽瓣膜。