[發明專利]一種多肽抗原檢測牛結核分枝桿菌抗體的ELISA試劑盒

有效

• 申請號: 201610014747.1
• 申請日: 2016-01-11
• 公開（公告）號: CN105527446B
• 公開（公告）日: 2017-12-08
• 發明（設計）人: 秦愛建;邵紅霞;葉建強;錢琨;趙巍
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/543
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務所32106
• 代理人: 江平

技術領域

本發明屬于生物技術檢測技術領域。

背景技術

牛結核是由牛結核分枝桿菌引起的人獸共患傳染病。在國際上已引起巨大經濟損失，牛結核可以感染其他反芻動物和人類，野生動物是其儲存宿主，給疾病控制與根除造成很大困難。目前，用于牛結核標準診斷方法是用結核菌素進行皮內試驗，該方法和其他細胞介導的免疫學檢測（如r-IFN試驗，淋巴細胞增生試驗）均有一些優缺點。首先是由于皮內試驗是機體對抗原的遲發型變態反應，敏感性和特異性較低，也不可能確定對結核菌素反應的是牛結核分枝桿菌，還是禽結核分枝桿菌，或是環境中的其他分枝桿菌。其次，在感染早期細菌載量雖然較少，但以細胞介導的免疫反應為主，而在感染嚴重期細菌載量雖然較高但細胞介導的免疫反應可能缺失，動物可能成為對細胞介導的免疫反應無應答。第三，72小時內需要操作動物個體兩次，以獲得檢測結果。第四，細胞介導的免疫學檢測價格昂貴，需要專業培訓，解讀檢測結果。第五，環境中的分枝結核桿菌或BCG疫苗免疫的動物可能使檢測結果成為假陽性。因此，需要建立敏感、易操作和應用的檢測牛結核的血清學方法，這種方法能夠區別牛結核和禽結核，或其他環境分枝結核桿菌。

近年來有一些用于牧場檢測的血清學方法，但敏感性較低，特異性也較差，或許是由于使用了病原分支桿菌和環境分支桿菌表達的抗原提取物。這可以通過利用病原唯一抗原進行加以改進，而且已經取得一定進展。

發明內容

為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的在于提供一種多肽抗原檢測牛結核分枝桿菌抗體的ELISA 試劑盒。

本發明包括牛結核分枝桿菌特異性多肽抗原包被的酶標板、陰性血清、陽性血清、抗體稀釋液、用辣根過氧化物酶標記的抗牛IgG酶標抗體、底物顯色液、終止液；所述牛結核分枝桿菌特異性多肽抗原為以下五種多肽抗原中的至少任意一種：

bTB-p-1 MAEMKTDAATLAQEAGNFMTEQQWNFAGIEAAAS；

bTB-p-2 QEAGNFERISGDLKTQAGIEAAASAIQGNVTS；

bTB-p-3 VVRFQEAANKQKQELDEIAIQGNVTSIHSLLDEG；

bTB-p-4 NIRQAGVQYSRADEEQQQKWDATATELNNALQNL；

bTB-p-5 RADEEQQQALSSQMGFGQAMASTEGNVTGMFA。

所述五種多肽抗原為利用牛結核分支桿菌特異性多肽，采用體外人工合成方法取得的多肽抗原。

本發明利用人工合成多肽作為抗原，以獲得靈敏度高、特異性高、操作簡單、并快速檢測牛結核分枝桿菌抗體的ELISA 檢測試劑盒。

本發明的有益效果：本發明采用牛結核分枝桿菌特異性多肽抗原作為包被抗原，有效提高多肽與目標抗體的結合效率，從而顯著提高可檢測靈敏度，同時顯著降低非特異背景讀值，特異性高，本發明的牛結核分枝桿菌抗體的ELISA 試劑盒具有操作簡單、診斷速度快、在進行大規模檢測中經濟方便等優點，是一種便于普及的好方法，具有廣泛的應用前景。采用本發明的ELISA 檢測試劑盒檢測牛結核分枝桿菌抗體，降低了檢測成本，有利于推廣使用。

進一步地，本發明所述牛結核分枝桿菌特異性多肽抗原包被的酶標板的制備方法是：取96孔酶標板，每孔100μL牛結核分枝桿菌特異性多肽抗原，4℃過夜包被，包被濃度為0.01μg/mL～5μg/mL，用PBST 洗滌液250μl/ 孔洗滌2～4 次后拍干，用封閉液150μl/孔，37℃封閉1h，洗滌液PBST 250μl/ 孔洗滌3 次后拍干，放入真空袋，4℃、抽真空保存。

所述陽性血清為用抗體稀釋液按照體積比為1∶20～100 的比例將牛結核分枝桿菌標準陽性血清稀釋后取得的稀釋陽性血清；所述陰性血清為用抗體稀釋液按照體積比為1∶20～100 的比例將牛結核分枝桿菌標準陰性血清稀釋后取得的稀釋陰性血清。所述標準陽性、陰性血清用于評價試劑盒檢測結果的有效性。

所述抗體稀釋液為0.1%BSA，以用于保持血清抗體的效價和穩定性，減少非特異性。

所述用辣根過氧化物酶標記的抗牛IgG酶標抗體是用HRP保護液按1：2000-1：5000 比例稀釋后的抗牛IgG酶標抗體。保護液保護酶標抗體的穩定性和效價。

所述底物顯色液為TMB，使陽性樣本呈現不同深淺顏色，從而判定陽性的強弱。

所述終止液為0.1SDS%或2M的H₂SO₄，使酶促反應終止。

具體實施方式