[發明專利]一種極速獲得分生孢子的方法

有效

• 申請號: 201610013554.4
• 申請日: 2016-01-07
• 公開（公告）號: CN105483073B
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發明（設計）人: 李文佳;呂延華;李全平;張宗耀
• 申請（專利權）人: 廣東東陽光藥業有限公司;宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物科學領域，特別涉及一種極速獲得分生孢子的方法。

背景技術

冬蟲夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sunget et al.]是我國青藏高原特產的傳統名貴中藥材，它是冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科蝙蝠蛾屬昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體。近年來，隨著冬蟲夏草營養及藥用價值認識的普及，加之人們生活水平不斷提高，對冬蟲夏草的需求不斷增大，導致亂采濫挖不斷加劇，資源破壞越來越嚴重，致使冬蟲夏草資源銳減，人工培植冬蟲夏草勢在必行。由于現有技術存在幼蟲染菌率低或染菌后存活率低等問題，一直制約著人工培植冬蟲夏草規模化發展，多年的研究證實，中國被毛孢(H.sinensis)為冬蟲夏草菌的無性型，分生孢子作為中國被毛孢生活史中極為重要的一個環節，在冬蟲夏草侵染和形成過程中起著十分關鍵的作用，有研究表明采用中國被毛孢分生孢子來侵染蝙蝠蛾幼蟲能夠明顯提高侵染率。

目前，常用的獲得中國被毛孢分生孢子的方法有：固體發酵誘導和微循環產孢。

固體發酵誘導獲得分生孢子的周期較長，一般為60～90天，導致培養過程中的染菌幾率增加，且產量不穩定，受限于中國被毛孢菌株類型及固體培養基的優劣。

微循環產孢是真菌的孢子萌發后，不經過(或僅有極微弱的)菌絲生長階段，直接從孢子上產生產孢結構和孢子。該方法產孢周期短多用于冬蟲夏草菌無性型的鑒定，莫明和等在期刊《菌物系統》2001年第4期發表的文章“冬蟲夏草的微循環產孢及其無性型的分離”中公開了在載玻片上加一滴薩氏培養基，將子囊孢子點接于培養基上進行微循環產孢，5天后產生分生孢子，根據分生孢子的顯微特征對其進行鑒定，作者認為該方法簡便可靠，具有很好的實用性。肖巖巖等在期刊《安徽農業大學學報》2011年38卷第1期發表的文章“冬蟲夏草子囊孢子及其無性型在培養過程中的形態學觀察”中將中國被毛孢分生孢子接入液體培養基，進行微循環產孢后，結合分子生物學技術手段將分離到的菌株鑒定為中國被毛孢。可見，傳統的微循環產孢以培育出少量的分生孢子作為冬蟲夏草菌無性型的鑒定為目的，并不追求分生孢子的產量，未對微循環產孢的環境溫濕度和營養條件做深入的研究。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種改良的微循環產孢的的方法，該方法不僅培養周期短、成本低，而且工藝穩定、產率高，為成功侵染蝙蝠蛾幼蟲提供穩定的分生孢子來源。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種極速獲得分生孢子的方法，將中國被毛孢子囊孢子溶液均勻涂抹于蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲 蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅的表面，分別置于墊有濕濾紙的培養皿內，在溫度12～18℃，相對濕度60～90％，避光的無菌環境下培養24～96h，即得中國被毛孢分生孢子。對蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅表面進行洗脫，收集分生孢子。

一些實施例中，本發明所述的中國被毛孢子囊孢子溶液，包含具有保濕和粘附作用的溶劑，優選的為2～5％甘油水溶液。

一些實施例中，本發明所述的中國被毛孢子囊孢子溶液，孢子的濃度為4500～5500個/ml，優選的為5000個/ml。

一些實施例中，本發明所述的將中國被毛孢子囊孢子溶液均勻涂抹于蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅的表面，涂抹工具為柔性工具，不損傷幼蟲，柔性工具可以是毛筆、布條、棉簽等，優選的為毛筆。

一些實施例中，本發明所述的將中國被毛孢子囊孢子溶液均勻涂抹于蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅的表面，每個載體的涂抹量為15～25μl，優選的為20μl。

一些實施例中，本發明所述的將中國被毛孢子囊孢子溶液均勻涂抹于蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅的表面，蝙蝠蛾幼蟲優選的為3～5齡的活的幼蟲。

一些實施例中，本發明所述的墊有濕濾紙的培養皿，濾紙濕度控制為充分潤濕，滿盈但不溢出水分。每天檢查，根據濾紙的水分狀況進行補加水處理。

一些實施例中，本發明所述的培養環境，優選的為溫度14～16℃，相對濕度65～85％，避光的無菌環境。

一些實施例中，本發明所述的對蝙蝠蛾幼蟲體表、蝙蝠蛾幼蟲蟲蛻或蝙蝠蛾成蟲翅表面進行洗脫，洗脫液優選的為含0.1％吐溫80的0.003mol/l KH₂PO₄緩沖液。