[發明專利]自然殺傷細胞脫顆粒的流式細胞術檢測方法有效
| 申請號： | 201610013454.1 | 申請日： | 2016-01-08 |
| 公開（公告）號： | CN105445171B | 公開（公告）日： | 2018-03-02 |
| 發明（設計）人： | 王昭 | 申請（專利權）人： | 首都醫科大學附屬北京友誼醫院 |
| 主分類號： | G01N15/14 | 分類號： | G01N15/14 |
| 代理公司： | 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙)11371 | 代理人： | 欒波 |
| 地址： | 100000*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 自然 殺傷 細胞 顆粒 檢測 方法 | ||
1.一種自然殺傷細胞脫顆粒的流式細胞術檢測方法，其特征在于，包括：通過自然殺傷作用或抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用激發自然殺傷細胞脫顆粒，再用流式細胞術檢測自然殺傷細胞中囊泡膜蛋白標志物CD107a陽性的細胞占總自然殺傷細胞的比例在激發脫顆粒前后的變化幅度來評價其脫顆粒能力；
所述的檢測方法具體包括以下步驟：
1)、分離待檢樣本中的外周血單個核細胞及并計數調整細胞濃度至1.8～2.2×106/ml；
2)、取自然殺傷細胞天然靶細胞并計數調整細胞濃度至1.8～2.2×106/ml，所述自然殺傷細胞天然靶細胞為K562細胞或P815細胞；
3)、將步驟1)中的所述外周血單個核細胞和步驟2)中的所述自然殺傷細胞天然靶細胞按體積等比混合，得到細胞混合液；將所述細胞混合液于37℃，5％CO2培養箱中共孵育2.5～3.5h后離心并棄上清，得到沉淀；
當所述自然殺傷細胞天然靶細胞為P815細胞時，孵育之前還需要在所述細胞混合液中加入抗人CD16抗體；所述抗人CD16的抗體濃度為0.25～0.5μg/100μl；
4)、加入流式染色緩沖液重懸步驟3)中所述沉淀，同時加入抗CD3、CD56、CD107a的流式抗體并孵育；
在步驟4)中，CD3、CD56的抗體的濃度為0.45～1.0μg/100μl；CD107a的抗體濃度為0.06～0.125μg/100μl
5)、待孵育完成后離心，用流式染色緩沖液洗滌沉淀；
6)、洗滌后用流式染色緩沖液重懸混勻細胞并用流式細胞儀進行檢測；
7)、統計CD3-CD56+CD107a+的細胞占CD3-CD56+細胞的比例在激發脫顆粒前后的變化幅度用以評價自然殺傷細胞脫顆粒能力。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，在步驟4)中，孵育條件為：
室溫避光孵育15～25min。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述流式染色緩沖液的配方為：
含有2.0％FBS和2.0mM EDTA的1×PBS溶液。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，在步驟2)、步驟3)和步驟5)中，所述離心的轉速均為1200～1600rpm，離心時間均為4～6min。
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