[發(fā)明專利]一種胚胎干細(xì)胞向肝臟組織結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)分化的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610013206.7
• 申請(qǐng)日: 2016-01-06
• 公開（公告）號(hào): CN105543175B
• 公開（公告）日: 2020-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡安斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N5/071
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胚胎干細(xì)胞向肝臟組織結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)分化的方法。本發(fā)明將E?cadherin基因作為外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，得到高效表達(dá)E?cadherin基因的胚胎干細(xì)胞，然后培養(yǎng)分化，得到擬胚體，將其移植至含有EMT抑制劑的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到三維生長(zhǎng)的肝臟組織結(jié)構(gòu)。本發(fā)明首次從細(xì)胞黏附和EMT水平的角度研究ESC體外向肝臟組織結(jié)構(gòu)分化，E?cadherin轉(zhuǎn)染后表達(dá)水平穩(wěn)定控制，可保持細(xì)胞分化中足夠的細(xì)胞黏附力，使其不易分散為單層細(xì)胞；降低胚胎干細(xì)胞體外分化過(guò)快的EMT水平，調(diào)控分化肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞以及肝間質(zhì)細(xì)胞同步分化以形成肝臟組織，更加符合體內(nèi)組織發(fā)育機(jī)理。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胚胎干細(xì)胞向肝臟組織結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)分化的方法。

背景技術(shù)

當(dāng)今胚胎干細(xì)胞(ESC)向肝臟方向分化研究中，分化研究水平仍多限于單細(xì)胞狀態(tài)，即僅能分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞(BEC)等肝系細(xì)胞，缺點(diǎn)包括單一的細(xì)胞類型和不能進(jìn)一步形成肝臟組織結(jié)構(gòu)。現(xiàn)有技術(shù)也曾成功誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化，但分化細(xì)胞仍呈單細(xì)胞狀態(tài)而很難形成肝組織。有學(xué)者研究改善胚胎干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞狀態(tài)，如通過(guò)聚氨酯支架等三維培養(yǎng)使分化肝細(xì)胞形成聚合體，但僅能改善其物理性態(tài)，不能形成包含肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、血管結(jié)構(gòu)等間質(zhì)成分的真正意義上的肝臟組織。

作為功能復(fù)雜的器官組織，肝臟不僅需要肝細(xì)胞的合成代謝及解毒等功能，還需要膽管上皮的運(yùn)輸功能，以及其他間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌和免疫調(diào)節(jié)等功能。如要在治療中達(dá)到較全面的肝功能替代效果，僅靠獲得數(shù)量和功能滿意的單一的肝細(xì)胞是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，需要分化為由肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管成分等組成的肝臟組織結(jié)構(gòu)。

研究人員發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞在體外向肝系細(xì)胞分化過(guò)程中，由單個(gè)胚胎干細(xì)胞首先分化發(fā)育為包含三胚層結(jié)構(gòu)的擬胚體(embryonic body，EB)，再進(jìn)而由擬胚體分化為包含肝系細(xì)胞的細(xì)胞群落。期間，擬胚體向細(xì)胞群落分化過(guò)程中，細(xì)胞間黏附力較體內(nèi)胚胎發(fā)育時(shí)明顯下降，從而很容易失去擬胚體的三維組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)而逐漸變?yōu)閱螌拥募?xì)胞分化群落，即只能分化為單層的肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞，而不能形成肝臟組織。同時(shí)，擬胚體在體外分化過(guò)程中，的細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)速度(水平)過(guò)快(過(guò)高)，使得肝系細(xì)胞分化時(shí)程與肝臟間質(zhì)成分如血管結(jié)構(gòu)等分化時(shí)程脫節(jié)，因此在分化得到的肝細(xì)胞中間也缺乏血管間質(zhì)成分，也就不能形成真正意義上的肝臟組織結(jié)構(gòu)。

上皮型鈣粘蛋白(Epithelial-cadherin,E-cadherin)是介導(dǎo)肝臟組織中細(xì)胞間黏附的主要黏附分子，通過(guò)介導(dǎo)肝細(xì)胞黏附而調(diào)控肝臟組織發(fā)育信號(hào)傳導(dǎo)。分泌型卷曲相關(guān)蛋白-1(secreted frizzled-related proteins,sFRP-1)可通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)而降低細(xì)胞培養(yǎng)中的EMT水平，減緩肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和血管等肝臟間質(zhì)細(xì)胞的分化時(shí)程，是二者分化達(dá)到同步，有利于分化出各種肝臟組織成分。

目前沒(méi)有相關(guān)研究通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞黏附力和減緩細(xì)胞分化中EMT速度實(shí)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞分化為真正意義上的肝臟組織結(jié)構(gòu)。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種胚胎干細(xì)胞向肝臟組織結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)分化的方法。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種胚胎干細(xì)胞向肝臟組織結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)分化的方法，包含如下步驟；

(1)將E-cadherin基因作為外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，得到高效表達(dá)E-cadherin基因的胚胎干細(xì)胞(E-cadherin-ESC)；

(2)將步驟(1)得到的高效表達(dá)E-cadherin基因的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)分化，得到包含三胚層結(jié)構(gòu)的擬胚體(EB)；