[發明專利]一種馬來穿山甲線粒體Cox3基因序列的擴增引物及鑒定方法

有效

• 申請號: 201610012778.3
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105543365A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 龔世平;李偉業;滑溜帥;葛研;王付民;侯方暉
• 申請（專利權）人: 廣東省昆蟲研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于生物化學與分子生物領域，具體涉及一種馬來穿山甲線粒體Cox3基因序列的 擴增引物及鑒定方法。

背景技術：

馬來穿山甲(Manisjavanica)隸屬于鱗甲目、穿山甲科、穿山甲屬，主要分布于泰國、 馬來西亞、緬甸、印尼、新加坡等地，生活在低海拔森林及次生林中。馬來穿山甲的鱗片具 有很高的藥用價值，近年來，過渡獵捕導致馬來穿山甲野生資源日益減少，已被IUCN列為 極危動物。為了保護野生資源，恢復馬來穿山甲野生種群數量，研究其種群遺傳結構和野生 群體遺傳變異水平非常必要。

分子標記是在DNA水平上對遺傳多樣性的直接反映，具有數量多，多態性好，遺傳穩 定等優勢，是研究遺傳變異的理想方法。其中，線粒體基因是一個非常有效的遺傳標記，與 核基因相比,線粒體基因具有母系遺傳、結構簡單、進化速率快等獨特的遺傳特性，被廣泛 應用于物種鑒定和群體遺傳多樣性等研究。因此，線粒體基因是進行馬來穿山甲物種鑒定、 群體結構和遺傳變異研究的有效工具。

發明內容：

本發明的目的是提供一種馬來穿山甲線粒體Cox3基因序列的擴增引物及鑒定方法，利用 該擴增引物，按照本發明的鑒定方法能夠特異性的擴增出馬來穿山甲線粒體Cox3基因，用于 鑒定是否是馬來穿山甲物種，為馬來穿山甲的保護遺傳學、進化遺傳學及其物種的分子鑒定 提供基礎。

本發明的馬來穿山甲線粒體Cox3基因序列的擴增引物，其特征在于，所述的擴增引物為：

F：5’-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3’，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；

R：5’-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3’，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本發明的另外一個目的是提供馬來穿山甲的鑒定方法，其特征在于，提取待測穿山甲的 基因組DNA，然后利用上述擴增引物，以待測穿山甲的基因組DNA作為模板，進行PCR擴 增，如果擴增不出來片段，則待測穿山甲不是馬來穿山甲，如果能夠擴增出擴增片段，將擴 增片段進行測序，如果擴增片段的核苷酸序列與SEQIDNO.3所示的序列相同或者相似度達 到95％以上，則為馬來穿山甲，否則則不是馬來穿山甲。

按照本發明的鑒定方法能夠特異性的擴增出馬來穿山甲線粒體Cox3基因，用于鑒定是否 是馬來穿山甲物種，為馬來穿山甲的保護遺傳學、進化遺傳學及其物種的分子鑒定提供基礎。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

實施例1：

(1)馬來穿山甲基因組DNA的提取

剪取馬來穿山甲肌肉組織于2mL離心管中，將組織剪碎，加800μL消化緩沖液，10μL 蛋白酶K(20mg/mL)，混勻后于55℃消化過夜。消化清透后，加入800μL飽和酚，輕輕 顛倒混勻20min，10000g離心10min，抽提上清。加入400μL飽和酚，400μL氯仿/異戊醇 (24:1)，輕輕顛倒混勻20min，10000g離心10min，抽提上清。加入800μL氯仿/異戊醇 (24:1)，輕輕顛倒混勻20min，10000g離心10min，抽提上清。加入1mL預冷的無水乙醇， 于-20℃冷凍2h，12000g離心15min，棄上清。加預冷的70％乙醇，小心洗滌DNA沉淀兩 次，12000g離心5min，棄上清。晾干乙醇，加入50μL超純水溶解沉淀，置于-20℃保存備 用，得到馬來穿山甲基因組DNA。

(2)PCR擴增Cox3基因片段

上游引物F：5’-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3’；

下游引物R：5’-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3’。