[發明專利]一種基于鎖式探針滾環擴增直接針對血液樣品進行SNP分型檢測的試劑及應用

有效

• 申請號: 201610012695.4
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105463108B
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 楊會勇;饒華春;刁勇;王清瑤;鄭晨娜;許超塵
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 戴中生

1.一種基于鎖式探針滾環擴增直接針對血液樣品進行SNP分型檢測的試劑，其特征在于：所述試劑通過如下具體操作步驟制備而成：

(1)鎖式探針與擴增引物的設計：從genebank數據庫獲取ERAP1基因上SNP位點rs27044所有參考基因型，并獲取此單核苷酸多態性位點上下游各500bp的基因序列，用primer 5.0軟件設計出兩等位基因特異性鎖式探針與兩擴增引物；其中：

檢測rs27044位點：兩鎖式探針：Pro-1 5'-TGAGGCGTCGTAAGCCATAAGTAGGATAGGACAGGAAAGAAACGCTCCTCATCATCAAG-3'，Pro-2 5'-TGAGGCGTCGTAAGCCATAAGTAGGATAGGACAGGAAAGAAACGCTCCTCATCATCAAC-3'；兩擴增引物：第一引物5'-CTTTCCTGTCCTATCCTACTTATG-3'，第二引物5'-CTCCTCATCATCAACTG-3'；

(2)鎖式探針磷酸化：對設計所得的等位基因特異性鎖式探針的5′端進行磷酸化反應，具體地，分別取0.1μmol等位基因特異性鎖式探針加入到10μL T4磷酸化激酶反應緩沖液中：往反應體系中加入1mM dATP、2.0U的T4多核苷酸激酶，37℃孵育30分鐘；得磷酸化后的鎖式探針；

(3)鎖式探針成環反應：取10μM待檢測樣品即外周血樣品，加入濃度為10μM的上述磷酸化后的鎖式探針0.5μL，并加入1μL 10×Taq DNA連接酶緩沖液，另添加適量BSA、甘油、調整Mg2+濃度為10Mm，PH值為9.3，6.5μL的無菌雙蒸水，接著加入10μL的礦物油封閉，95℃5min，室溫10min；然后加入40U/μL的Taq DNA連接酶0.5μL，95℃ 5min，45℃ 4小時成環反應；最后95℃滅活15min；

(4)酶切反應：在上述成環反應液中加入1.1μL 10×Exo III緩沖液，然后再加入0.4μL10U/μL的核酸外切酶I和0.2μL 100U/μL的核酸外切酶III；于37℃孵育1h，85℃孵育30min滅活核酸外切酶；

(5)滾環擴增反應：取上述酶切后的成環反應產物3μL，加入兩條濃度為10μM的擴增引物各0.5μL，接著加入1μL10×ThermoPol Reaction Buffer、3.9μL的無菌雙蒸水，之后加入10μL的礦物油封閉，95℃5min，室溫10min，然后于反應液中加入20x BSA 1μL、10mMdNTPs0.8μL、8U/μL Bst DNA聚合酶0.3μL，并于65℃反應2h，得到基于鎖式探針滾環擴增直接針對血液樣品進行SNP分型檢測的試劑；

所述10×Taq DNA連接酶緩沖液的組分為：200mM Tris-HCl、250mM KAc、100mM Mg(Ac)₂、100mM DTT、10mM NAD、0.1％Triton X-100、pH 7.6，成環反應體系還含有0.2mg/ml的BSA、13％甘油、調整Mg2+濃度為10Mm，PH值為9.3。

2.根據權利要求1所述一種基于鎖式探針滾環擴增直接針對血液樣品進行SNP分型檢測的試劑，其特征在于：所述10×Exo III緩沖液，緩沖液由500mM pH為8.0的Tris-HCl，50mM MgCl₂，100mM疏基乙醇組成。

3.根據權利要求1所述一種基于鎖式探針滾環擴增直接針對血液樣品進行SNP分型檢測的試劑，其特征在于：所述10×ThermoPol Reaction Buffer的組分為：200mM pH為8.8的Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)₂SO₄、20mM MgSO₄、0.1％Triton X-100。

4.根據權利要求1所述一種基于鎖式探針滾環擴增直接針對血液樣品進行SNP分型檢測的試劑，其特征在于：所述T4磷酸化激酶反應緩沖液的組分為：70mM pH為7.6的Tris-HCl、10mM MgCl₂、5mM DTT。