[發明專利]一種亞棕裸蠓的特異基因及其分子鑒定方法

有效

• 申請號: 201610012039.4
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105420399B
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 楊美瓊;黃恩炯;王宇平;高博;張建慶;王飛鵬
• 申請（專利權）人: 福建國際旅行衛生保健中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

本發明公開一種亞棕裸蠓的特異基因及其分子鑒定方法，其特征在于采用分子生物學方法獲取該裸蠓的18S rDNA基因序列，通過基因序列相似性的比對，對該裸蠓進行種類鑒定。本發明提供的亞棕裸蠓分子鑒定方法，有利于實現亞棕裸蠓準確、快速的鑒定。

技術領域

本發明涉及物種鑒定領域，具體涉及亞棕裸蠓的特異基因序列及其分子鑒定方法。

背景技術

蠓類是雙翅目中的微小型昆蟲，俗稱小咬。目前，對蠓類的鑒定主要依靠經驗豐富的分類學專家識別形態學特征來實現，一旦遇到近緣種和形態特征掌握不全的標本鑒定就很棘手；而且，對吸血蠓的形態鑒定需要通過制作玻片標本來完成，操作步驟繁瑣、周期長、難度大，因此，亟需尋求一種新的方法，以彌補傳統分類方法的缺陷。

分子鑒定技術是以遺傳物質DNA序列分析為依據來闡明物種間的差別，從分子水平上快速而準確地鑒別物種。它是分子生物學、計算機科學與傳統分類學相結合的產物，作為一種嶄新的分類學技術，極大彌補了傳統形態學鑒定的缺陷，已引起越來越多生物學家們的重視。近年來，隨著以PCR基礎的DNA序列測定方法的建立和廣泛使用，核糖體DNA（rDNA）和線粒體DNA（mtDNA）等基因逐漸受到重視，并在吸血蠓的分子鑒定中得到廣泛應用。該技術與傳統的分類方法互為佐證，不僅可解決鑒定中標本殘缺不全等問題，而且可實現吸血蠓的快速鑒定。本發明提供的亞棕裸蠓特異基因序列有利于實現亞棕裸蠓的快速鑒定，縮短鑒定時間。

發明內容

本發明的目的在于提供一種亞棕裸蠓的特異基因序列及其分子鑒定方法。通過分子生物學方法獲取亞棕裸蠓（Atrichopogon subfusculus）特異基因—18S rDNA基因序列，通過基因序列相似性的比對，可準確、快速地鑒定亞棕裸蠓。

為實現上述目的，本發明通過如下技術方案實現：

采用小型昆蟲微量DNA 模板制備方法，通過改進的PCR 反應條件，由合成的引物擴增亞棕裸蠓的18S rDNA基因，PCR產物序列送由專業生物公司測定。測序結果通過手工校對、序列拼接，并在NCBI 中進行Blast 相似性搜索，確保所得序列為目標序列。本發明所述的一種亞棕裸蠓特異基因，為18S rDNA基因，所述裸蠓的18S rDNA基因序列如SEQ ID No.1所示（不含引物）：

所述的亞棕裸蠓18S rDNA基因的PCR引物，其特征在于PCR引物序列為：

正向引物 5’CCTGAGAAACGGCTACCACATC 3’

反向引物 5’GTTTCAGCTTTGCAACCAT 3’。

本發明所述的亞棕裸蠓的分子鑒定方法，包括：

1）從待測的昆蟲組織中分離提取DNA；

2）以該DNA為模板，采用的引物為：正向引物5’CCTGAGAAACGGCTACCACATC 3’，反向引物5’GTTTCAGCTTTGCAACCAT 3’，通過聚合酶鏈式反應擴增出該昆蟲的18S rDNA基因；

3）然后取適量步驟2）的聚合酶鏈式反應擴增出的18S rDNA基因用瓊脂糖電泳分離，經溴乙錠染色后于紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定結果。若能相應地特異性擴增出大小約為784 bp的條帶，送生物公司測序；

4）根據測序結果，若目標基因序列與SEQ ID No.1的相似性在98%以上，即可判斷所述的待測組織為亞棕裸蠓。

亞棕裸蠓的種類鑒定依靠形態學鑒定所實現，并經權威專家復核，從而保證了結果的可靠性。

所述引物根據文獻合成，正向引物5’CCTGAGAAACGGCTACCACATC 3’，反向引物5’GTTTCAGCTTTGCAACCAT 3’。