[發(fā)明專利]一種大腸桿菌重組表達結核分枝桿菌Rv2837c活性蛋白的方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610011743.8
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105567660B
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發(fā)明（設計）人: 柏銀蘭;徐志凱;王麗梅;王立飛;康健;路延之;褚陽光;劉知鑫;高俊;吉思雨;曹田宇
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/70;G01N33/569;A61K39/04;A61P31/06
• 代理公司: 西安文盛專利代理有限公司 61100
• 代理人: 彭冬英

本發(fā)明涉及一種大腸桿菌重組表達結核分枝桿菌Rv2837c活性蛋白的方法及其應用。將結核分枝桿菌Rv2837c蛋白基因克隆入原核表達載體pET28a+，命名為pET?CnpB。采用Ni離子親和層析法獲得純化的Rv2837c活性蛋白。重組Rv2837c蛋白可用于檢測結核分枝桿菌感染動物和病人血清。重組Rv2837c蛋白可誘導小鼠高水平的體液和細胞免疫應答，可用于結核病新型亞單位疫苗的研制。因此，Rv2837c蛋白具有良好的應用前景。本發(fā)明涉及該活性重組蛋白在制備結核病診斷和預防制劑或藥物中的應用。

技術領域

本發(fā)明屬于結核診斷試劑和疫苗領域。本發(fā)明涉及一種大腸桿菌重組表達并獲得結核分枝桿菌Rv2837c活性蛋白的方法。本發(fā)明還涉及該重組蛋白在制備結核病診斷和預防制劑或藥物中的應用。

背景技術

結核病流行現狀

結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的慢性傳染病，目前仍然是全世界范圍內危害最嚴重的傳染病。據WHO報告，全世界已有約1/3人口感染結核分枝桿菌，2013年新發(fā)患者約900萬，在所有傳染病中結核病死亡率僅次于艾滋病。WHO將TB與艾滋病、瘧疾一起列為人類最主要的傳染性殺手。我國屬于全球22個TB高負擔國家之一，在我國27種法定報告?zhèn)魅静≈信诺谝晃弧Ｎ覈l(wèi)生部將TB列為全國重點控制的重大疾病之一，國家“十一五”和“十二五”重大傳染病專項課題均將結核病列為重點研究對象之一。

結核病診斷研究現狀

顯微鏡鏡檢、痰培養(yǎng)是病原體檢測的主要手段，但以病原體的檢出為基礎的診斷方法存在實驗周期長、敏感度低、特異性不理想以及耗時長等缺點。分子生物學方法如PCR、雜交和基因和蛋白芯片也已應用于結核病的快速診斷，但因其檢出率不理想，且存在技術要求高、價格昂貴等原因，不適用于臨床大規(guī)模篩選。積極研究新型的診斷方法和試劑有助于結核病的控制。

免疫學技術的迅猛發(fā)展促進了診斷技術的發(fā)展。人類感染結核分枝桿菌后，產生免疫力的同時發(fā)生遲發(fā)型超敏反應。結核菌素試驗是通過測定機體對結核分枝桿菌有無超敏反應，判定受試者是否具有抗結核分枝桿菌的細胞免疫，以判斷受試者是否感染該病原菌的一種方法。以此原理研制的結核菌素試驗(PPD)目前仍在臨床廣泛使用，但是由于卡介苗的廣泛接種，結核菌素試驗結果陽性并不能診斷為結核病，而更多用于疫苗效果監(jiān)測。

結核感染后，體內長期存在抗原特異性的記憶性T細胞，當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，產生多種細胞因子，其中IFN-γ是關鍵的細胞因子。IFN-γ釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRAs)是一種用于結核分枝桿菌感染的體外免疫檢測的新方法，在在鑒別活動性結核和潛伏結核感染、預測結核發(fā)病風險方面具有一定意義，但對臨床結核診斷價值比較局限，此外，T-SPOT.TB試驗技術操作要求高，試劑盒價格昂貴，也限制了其在經濟水平不高的國家和地區(qū)的應用。

血清學診斷通過檢測感染者血清結核特異性抗體水平，間接診斷結核病，具有特異性好、耗時短和易于批量檢測的顯著優(yōu)勢。目前選用結核分枝桿菌與卡介苗基因組差異區(qū)抗原，采用ELISA等方法檢測患者血清中特異性抗體進行輔助診斷的研究，研究比較深入的如早期分泌抗原靶6kD蛋白(early secretary antigenic target 6ku protein，ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白(culture filtrate protein，CFP-10)、脂阿拉伯甘露聚糖抗原、Ag85復合物、38KD蛋白、A60抗原、16KD蛋白、MPT64、MTB48等。這些抗原各具特點，雖然國內外多種結核血清學診斷試劑盒上市，但是其臨床報告結果不一，因此繼續(xù)篩序與疾病相關的特異抗原，組合已有的優(yōu)勢抗原，有助于開發(fā)出更有效的血清學診斷方法。

結核病亞單位疫苗研究現狀