[發明專利]一種拉沙熱病毒核蛋白及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610011711.8
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105505848A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 袁志明;黃弋;楊夢詩
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;G01N33/68;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于病原檢測技術領域，具體涉及一種拉沙熱病毒核蛋白NP的制備方法及 其在拉沙熱病毒核蛋白抗體檢測中的應用。結果顯示基因工程生產的拉沙熱病毒核蛋白NP 能與相應抗體特異性的結合，NP蛋白抗原用于NP抗體的檢測時具有很高的靈敏度和顯著的 特異性，具有開發成為檢測試劑盒的應用價值。

背景技術

拉沙熱病毒（Lassavirus,LAV）能夠引起拉沙熱（Lassafever）急性傳染疾病， 該疾病為人畜共患病，病程一般為1～4周，主要在尼日利亞、利比亞、塞拉里昂、幾內亞等 西非國家中流行，美洲、歐洲也曾發現輸入性病例，引起較高的發病率與死亡率。人感染拉 沙病毒后，大多數病人癥狀較輕，表現為發熱、嘔吐、腹瀉、咽炎等癥狀，嚴重者出現多臟器 功能障礙、衰竭，從而導致死亡，傳播能力極強。近年來，隨著中國和非洲經濟文化聯系的日 益密切，大量人員頻繁來往于中非之間，拉沙熱疫情將對中國的公共衛生體系建設和拉沙 熱疫情的防控帶來嚴峻的挑戰和威脅。為此，國家有關部門對此次疫情給以了高度關注，發 布了拉沙熱防控的指導性文件，啟動了相應的應急科技支撐項目。雖然拉沙熱病毒沒有在 世界范圍內造成大規模流行，但是，隨著經濟全球化進程的深入，非洲貿易、旅游、合作、及 人員往來的增多，拉沙熱病毒對各國人民的威脅與日俱增，像中國這樣一個人口眾多，人流 量大的國家，迫切需要對此類病毒的入侵做好儲備性工作，尤其是2014年西非的埃博拉出 血熱疫情的爆發，更需要特異性的檢測方法能對埃博拉出血熱等病毒感染和拉薩出血熱感 染進行鑒別。拉沙熱病毒感染的早期核酸和抗體檢測技術的建立和完善是有效進行拉沙熱 病毒防控的重要措施。

血清學檢測方法之中，敏感性和特異性最高的檢測方法是ELISA法，可用于檢測 拉沙熱病毒抗原、特異性IgM、IgG抗體，目前尚無商品化檢測試劑盒。原核表達系統pMal- c2x是基因工程技術中重要的的表達載體，其序列中具有誘導調控原件，可以人為控制蛋白 的表達。通常MBP標簽能夠增大在原核表達系統中表達的融合蛋白的可溶性，提高其表達 量。

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種含有拉沙熱病毒核蛋白NP蛋白基因的融合質粒， 該質粒表達能在細胞中能大量表達產生可溶性拉沙熱病毒核蛋白NP，適合作為檢測用抗 原，檢測方法靈敏度強，特異性好。

本發明的另一個目的是在于提供了一種拉沙熱病毒核蛋白NP的制備方法，該方法 簡單易行，操作方便，易于生產，制備的蛋白純度高，產量大，可溶性強，易純化，可快速獲得 較多且純度較高的重組蛋白。

本發明的再一個目的是在于提供了一種重組基因工程抗原拉沙熱病毒核蛋白NP 在ELISA檢測人群血清藥物中的應用，該應用方法效果佳，檢測靈敏度強，特異性好，操作簡 單，設備要求低、檢測周期短，有很廣的應用面。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：

其技術構思是：申請人將原核表達系統pMAL-C2X，通過基因工程手段，與拉沙熱病毒核 蛋白NP進行重組，獲得融合質粒（圖1）。原核表達系統生產融合抗原，方法簡單，不易污染。 成功構建的pMAL-C2X-LAV-NP表達載體，可以用于制備高產量、高純度的檢測用抗原拉沙熱 病毒核蛋白NP，且制備過程簡單方便，檢測活性高。

一種基因工程抗原拉沙熱病毒核蛋白NP的制備方法，其步驟是：

A、引物設計：設計兩條引物擴增拉沙熱病毒核蛋白NP基因，正向引物為5’-GAATTC ATGAGTGCCTCAAAGGAAAT-3’(F),反向引物為5’-GTCGACTTACAGAACGACTCT AGGTGTC-3’(R)；

B、PCR擴增基因：用擴增引物F（正向引物）和R擴增基因（反向引物），擴增模板為合成基 因，序列已公開（GeneBankaccessionnumberNC_004296）。PCR反應的試劑如下：將5μl的 10xTaq聚合酶緩沖液、1μl的dNTP混合物、1μl的引物F、1μl的引物R、1μl的擴增模板、1μl的 TaqDNA聚合酶和40μl的121℃、20min滅菌后的MiliQ超純水混合，PCR反應條件：94℃預變性 300秒、94℃變性30秒、53℃復性45秒、72℃延伸90秒、72℃最后延伸300秒，循環30次，獲得 擴增帶（圖2）。