[發(fā)明專利]一種親和LB膜定向固定化辣根過氧化物酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610011617.2
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105543209A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設計）人: 葉鵬;韓祝平;許永娟
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/08
• 代理公司: 浙江英普律師事務所 33238
• 代理人: 陳小良

技術領域

本發(fā)明涉及一種親和LB膜定向固定化辣根過氧化物酶方法，屬于蛋白質固 定化領域。

背景技術

辣根過氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量 小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是 由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個同 功酶組成，分子量為40,000，等電點為PH3～9，酶催化的最適PH因供氫體不同 而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下飽和度硫酸銨溶液。辣根過 氧化物酶通常來源于辣根(因此稱辣根過氧化物酶)，是臨床檢驗試劑中的常用 酶。該產品不但廣泛用于多個生化檢測項目，也廣泛運用于免疫類(ELISA)試 劑盒。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關鍵成分，對試劑盒的質量有重要 影響。

將具有生物活性的辣根過氧化物酶定向固定化，可以充分利用辣根過氧化物 酶的催化活性，在生物傳感器等領域有著重要的應用價值。但是，傳統(tǒng)的酶固定 化方法所獲得的固定化酶結構，酶是在任意位點和載體相連接，這種方法主要不 足之處在于常常導致固定化酶的活性出現(xiàn)大幅度下降。二羥苯丙氨酸(多巴)在 過氧化氫存在下可以被辣根過氧化物酶催化氧化，利用這一特性，可以使在無過 氧化氫的條件下使二羥苯丙氨酸與辣根過氧化物酶形成穩(wěn)定的親和作用。辣根過 氧化物酶定向共固定化，是利用酶底物分子與酶的親和作用，將辣根過氧化物酶 以有序的方向在載體上固定化，天然構象基本保持不變，這有助于高效實現(xiàn)辣根 過氧化物酶的生物功能，具有更重要的研究與應用價值。

發(fā)明內容

本發(fā)明的課題在于提供了一種親和LB膜定向固定化辣根過氧化物酶方法， 目的是克服傳統(tǒng)酶固定化方法的種種不足，實現(xiàn)酶的定向固定化的條件優(yōu)化。

為了解決上述課題，本發(fā)明采用如下技術：

一種親和LB膜定向固定化辣根過氧化物酶的方法，其特征在于，包括以下 步驟：

步驟一，步驟一，先將載體浸入緩沖溶液的液面下，注入改性底物分子，在 溶液表面形成單分子層膜，再將辣根過氧化物酶(HRP)溶液注入液面下，使改 性底物分子與辣根過氧化物酶形成親和作用；

步驟二，選擇合適表面壓，控制擋板以恒定速度壓至該表面壓并維持恒定， 垂直向上提拉載體出液面，將酶轉移至載體上。

作為優(yōu)選，步驟一中所述的載體材料為氧化石墨烯、石墨烯、碳納米管、石 墨、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、或聚丙烯腈中的至少一種。

作為優(yōu)選，步驟一中所述的改性底物分子為二羥苯丙氨酸十八烷基酯、二羥 苯丙氨酸十六烷基酯、或二羥苯丙氨酸二十烷基酯的至少一種。

作為優(yōu)選，步驟二中所述的液面表面壓為25-35mN/m，擋板恒定速度為 5-15mm/min，垂直向上提拉載體速度為1-5mm/min。

作為優(yōu)選，步驟一中所述的緩沖溶液為磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、檸 檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、碳酸、醋酸、巴比妥酸、或三羥甲基氨基甲烷中的 至少一種所配制的水溶液，濃度范圍5-50mM/L。

有益效果：

本發(fā)明同現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點及效果：采用將辣根過氧化物酶通過親 和LB膜定向固定化，可以高效保留固定化后辣根過氧化物酶的生物活性。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解 釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。

實施例1

步驟一，先將聚苯乙烯浸入磷酸溶液液面下，注入50μL1mM二羥苯丙氨酸 十八烷基酯，在溶液表面形成單分子層膜，待溶劑自然揮發(fā)10min后，再將50 μL1mg/mL辣根過氧化物酶(HRP)溶液注入液面下，靜置1h，使底物分子與酶 形成親和作用；

步驟二，液面表面壓為30mN/m，控制擋板以10mm/min恒定速度壓至該表 面壓并維持恒定，以3mm/min垂直向上提拉轉載體，將酶移至聚苯乙烯。

對比例

HRP的吸附法固定：取HRP0.45mg/mLHRP5mL，將聚苯乙烯浸入液面下，靜 置吸附1h后取出，用二次去離子水清洗3遍，除去未吸附疏松蛋白質，自然干 燥后用于活性測試。

HRP活性測試反應如下：