[發明專利]一種檢測急性單核細胞白血病的適配體、篩選方法與應用

在審

• 申請號: 201610010375.5
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105524926A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 夏薇;高麗君;王昶;孫娜;張亞麗;杜冰洋;高爽;王詩洋;張潮;巴宏宇
• 申請（專利權）人: 北華大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/574
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及急性單核細胞白血病檢測技術的研究領域，更具體地說，是可用于分 子水平上檢測急性單核細胞白血病的核酸適配體及其篩選方法和應用。

背景技術

白血病是一類造血干細胞的克隆性疾病，是一組高度異質性的惡性血液病，其特 點為骨髓和其他造血組織中的白血病細胞異常增生且分化成熟障礙，而使正常造血功能受 抑制，中青年以下人群尤其是兒童的發病率較高。目前臨床白血病診斷方法以傳統的FAB分 型和MICM分型為主。但形態學診斷方法，易受主觀因素的影響；免疫學、細胞遺傳學、分子生 物學分型診斷，存在周期長、操作復雜、費時費力或儀器設備成本高等缺點。如果能利用分 子生物學的原理，尋找到白血病細胞表面的特異性分子標志物，以此研發相應的診斷試劑 和靶向治療藥物將在日后的應用中發揮巨大的作用。

指數富集的配基系統進化技術（SystematicEvolutionofLigands ExponentialEnrichment，SELEX），是一種能獲取與靶分子高選擇、高親和力結合的寡核 苷酸的篩選技術，制備出的產物被稱為適配體（aptamers)。適配體安全、無毒，具備特殊的 三維結構，確保了其可與靶分子高特異性的結合，并可進一步改變靶分子的生物活性和生 命進程。適配體最大優勢是沒有免疫原性，并且分子量小、可化學合成、穩定性強、易于修飾 和標記，與傳統化學方法和免疫學方法相比具有無可比擬的優越性。近年來在傳統SELEX技 術基礎上，各類衍生SELEX技術如消減SELEX技術、自動化SELEX技術等也被不斷發展和完 善，被廣泛應用在生命科學研究、生物醫藥等領域，特別是在疾病的診斷與治療等方面，顯 示出廣闊的應用前景。目前已有幾種適配體診斷技術和適配體藥物進入到了臨床試驗或臨 床應用階段。

Cell-SELEX以完整細胞為靶標的消減SELEX技術。它是一種改良SELEX技術，其特 點是在經典的篩選過程中扣除與共有靶標結合的寡核苷酸序列，消減后的次級文庫繼續投 入到篩選中。憑借消減SELEX技術可實現從兩組高度同源的靶分子中，篩選到其中任意一種 靶分子的特異性寡核苷酸文庫。

細胞膜是由非常復雜的分子組成，特別在細胞膜表面存在著不同功能的蛋白質。 這些不同種類的蛋白質有著不同空間構像與結構域。蛋白質分子的結構域可以與其相應的 寡核苷酸鏈結合形成寡核苷酸鏈－蛋白質復合物。這種復合物的形成如同抗原與抗體的結 合一樣具有高特異性與高親和性。基于這種分子結合的特異性，以四種脫氧核苷酸為原料， 通過指數富集方式合成自由組合的寡核苷酸鏈（＜100mer)作為探針，應用白血病細胞表面 的蛋白質作為靶細胞靶點進行特異性篩選，篩選最終獲得的與目標白血病細胞高特異性結 合的DNA探針（又稱作核酸適配體）用于白血病細胞與正常細胞的鑒別、白血病的分類診斷 等。目前國內外尚無文獻報導針對急性單核細胞白血病診斷的特異生物探針。

本發明以人急性單核細胞白血病U-937細胞為靶細胞，應用Cell-SELEX技術通過正向及削減篩選過程制備了高特異性和高親和性的U-937細胞適配體（ssDNA），也稱診斷生物探針。該生物探針的特點如下：對急性單核細胞白血病細胞的細胞膜蛋白質靶點具有高度選擇性與高度親和性；急性單核細胞白血病-ssDNA文庫的構建，為未來的臨床應用提供了省時、簡便、成本低、效率高的保證；在生物探針合成的過程中可以依據試驗的需要進行生物化學的改造，例如連接生物素、羧基、氨基或者巰基。這些修飾并不影響生物探針對蛋白質靶點的辨認。基于該生物探針這一獨到的特點，該探針可以連接藥物分子、核酸酶阻抗堿基的修飾（保護核酸不被水解）。這樣有利于體內的試驗跟蹤以及直接將連接的藥物分子送達到白血病細胞表面，起到特異診斷與靶向治療的雙重效果。

發明內容

我們應用正向篩選同時穿插反向消減技術完成了高特異性和高親和性的急性單 核細胞白血病細胞適配體（AML-M5-ssDNA）的構建。因此本發明提供特異結合急性單核細胞 白血病細胞的核酸適配體探針；提供核酸適配體檢測急性單核細胞白血病的應用方法，為 急性單核細胞白血病的靶向治療奠定方法學基礎。具體步驟如下：

（1）合成隨機單鏈DNA文庫和引物

隨機單鏈DNA文庫：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA-40nt-TGGACACGGTGGCTTAGT- 3'

上游熒光素標記的引物：5'-FITC-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'