[發(fā)明專利]一種抗菌脂肽[△C1]Plipastatin及其產(chǎn)生菌和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610009626.8
• 申請(qǐng)日: 2016-01-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105505847B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 別小妹;劉洪霞;陸兆新;呂鳳霞;張充;趙海珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/75;C12P21/02;C07K14/32;C07K1/16;A01P1/00;A01P3/00;C12R1/125
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.一株產(chǎn)抗菌脂肽的枯草芽孢桿菌PB2-LC1，其特征在于該菌株通過(guò)以下步驟構(gòu)建得到：

(1)PMD-19T-△C1重組質(zhì)粒構(gòu)建：以保藏編號(hào)為CGMCC NO.11723的枯草芽孢桿菌PB2-L基因組DNA為模板，以SEQ ID NO.2所示的5′ppsC-D-△C1(ClaI)-F和SEQ ID NO.3所示的3′ppsC-D-△C1–SOE-R為引物進(jìn)行Plipastatin C和D亞基基因上游同源臂PCR擴(kuò)增；以SEQ IDNO.4所示的5′ppsC-D-△C1–SOE-F和SEQ ID NO.5所示的3′ppsC-D-△C1(KpnI)-R為引物進(jìn)行Plipastatin C和D亞基基因下游同源臂PCR擴(kuò)增；取等摩爾體積的上游和下游同源臂擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用的正向引物和反向引物分別為：SEQ ID NO.2所示的5′ppsC-D-△C1(ClaI)-F和SEQ ID NO.5所示的3′ppsC-D-△C1(KpnI)-R獲得融合的Plipastatin C和D亞基基因上游和下游同源臂片段；將上述獲得的融合的Plipastatin C和D亞基基因上游和下游同源臂片段與PMD-19T載體鏈接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichia coliDH5α，挑取單菌落，接種于含終濃度為100mg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，菌液經(jīng)PCR擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定，以及測(cè)序，得到含有Plipastatin C和D亞基基因上游和下游同源臂的PMD-19T-△C1質(zhì)粒；

(2)將溫敏型質(zhì)粒pKS2和PMD-19T-△C1質(zhì)粒分別用ClaI和KpnI雙酶切，連接pKS2酶切后的大片段和PMD-19T-△C1質(zhì)粒酶切后的小片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5α，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，成功構(gòu)建融合質(zhì)粒pKS2-△C1；

(3)將構(gòu)建好的融合質(zhì)粒pKS2-△C1轉(zhuǎn)化保藏編號(hào)為CGMCC NO.11723的枯草芽孢桿菌PB2-L菌株，以SEQ ID NO.6所示的5′PKS-1058-ERM-F和SEQ ID NO.75′PKS-1058-ERM-R為引物PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，通過(guò)同源重組的方法整合到枯草芽孢桿菌PB2-L菌株的基因組上獲得產(chǎn)抗菌脂肽的枯草芽孢桿菌PB2-LC1。

2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌PB2-LC1在產(chǎn)抗菌脂肽中的應(yīng)用。

3.一種利用權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌PB2-LC1制備抗菌脂肽的方法，其特征在于包括以下步驟：

a.將枯草芽孢桿菌PB2-LC1進(jìn)行培養(yǎng)，得到抗菌物質(zhì)發(fā)酵液；

b.抗菌物質(zhì)發(fā)酵液離心，收集上清液，酸沉，將沉淀進(jìn)行甲醇抽提并離心，離心所得上清液即為含抗菌脂肽的提取物；

c.抗菌提取物通過(guò)HPLC分離純化抗菌脂肽。