[發(fā)明專利]基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表達、提取和純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610008580.8
• 申請日: 2016-01-07
• 公開（公告）號: CN105441519B
• 公開（公告）日: 2019-03-12
• 發(fā)明（設計）人: 張淑梅;姜威;高娃;孟利強;劉宇帥;胡基華;曹旭;陳靜宇;李晶
• 申請（專利權）人: 黑龍江省科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22;C07K1/16;C07K1/14;C07K1/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市偉晨專利代理事務所(普通合伙) 23209
• 代理人: 榮玲

本發(fā)明公開了一種基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表達、提取和純化方法，以基因工程菌株ZSM?12(pET?22b?TasA?BL21)為對象，建立一種抗菌蛋白高表達方法；并且建立一種蔗糖和溶菌酶同時處理從細胞周質(zhì)空間提取抗菌蛋白方法以及一種改進的HIS柱純化抗菌蛋白方法。應用本發(fā)明，抗菌蛋白表達率達34.2％，菌體破壁后的抗菌蛋白含量高、雜蛋白少，HIS柱純化后蛋白純度為電泳一條帶，蛋白含量為67.8mg/l，蛋白收率為90.8％。純化后的抗菌蛋白具有抑制番茄灰霉病、葉霉病、玉米莖基腐病、小麥赤霉病菌和水稻稻曲病菌生長功能。

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，涉及一種基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表達、提取和純化方法。

背景技術

pET22b是商品化的原核表達載體，在N端融合一段疏水信號肽，能夠?qū)⒛康牡鞍邹D(zhuǎn)運到細胞周質(zhì)空間。由于大腸桿菌周質(zhì)空間中的蛋白量不到胞內(nèi)蛋白量的4％，分泌到周質(zhì)空間，目的蛋白占的比例高，且雜蛋白少，利于目的蛋白分離純化，然而，由于此載體的蛋白表達量及從細胞周質(zhì)中高效提取蛋白技術的限制致使該載體的應用較少。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是以基因工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)為對象，建立一種抗菌蛋白高表達方法；目的之二是建立一種蔗糖和溶菌酶同時處理從細胞周質(zhì)空間提取抗菌蛋白方法，目的之三是建立一種改進的HIS柱純化抗菌蛋白方法。應用本發(fā)明，抗菌蛋白表達率達34.2％，菌體破壁后的抗菌蛋白含量高、雜蛋白少，HIS柱純化后蛋白純度為電泳一條帶，蛋白含量為67.8mg/l，蛋白收率為90.8％。純化后的抗菌蛋白具有抑制番茄灰霉病、葉霉病、玉米莖基腐病、小麥赤霉病菌和水稻稻曲病菌生長功能。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種基于pET22b基因工程菌株的抗菌蛋白表達、提取和純化方法，具體實施步驟如下：

一、抗菌蛋白表達

取-70℃冷凍保藏的基因工程菌株ZSM-12(pET-22b-TasA-BL21)劃線接種于含氨芐青霉素的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)18h，挑較大菌落轉(zhuǎn)接于5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)液中(氨芐青霉素濃度為50μg/ml)，37℃，170r/min震蕩培養(yǎng)18h，然后按2％接種量接種到新鮮100ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中(氨芐青霉素濃度為50μg/ml)，30℃170r/min震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝1.2-1.8，加入IPTG至0.05-0.1mM，15-20℃震蕩培養(yǎng)4h。

二、抗菌蛋白提取

取100ml誘導表達后的菌液4℃5000r/min離心10min，收集菌體，加入10ml蛋白提取液(20mMTris.Cl，2.0mMEDTA，20％蔗糖，溶菌酶50mg/L，pH8.0)，室溫5min，10000r/min離心10min，收集沉淀，懸浮于2ml(20mM Tris.Cl，2.0mMEDTA，pH8.0)緩沖液中，即得抗菌蛋白提取液。

三、抗菌蛋白純化

取1ml Ni-His·Bind懸液至于5ml離心管中，10000r/min離心1min，用1.5-2.0ml無菌去離子水洗滌2次，加入1.5-2.0ml結合緩沖液平衡His柱，加入0.5-1ml蛋白提取液充分混合，室溫5-10min，10000rpm/min離心2min，棄上清，用3-4ml結合緩沖液洗滌4次，用3-4ml漂洗緩沖液洗滌4次，每次洗滌后用濾紙吸干殘液，去除雜蛋白，用0.5-1ml洗脫液洗脫目的蛋白2次，即得純化后的抗菌蛋白。