[發明專利]一種小麥花粉細胞電擊法轉化體系的優化方法及其應用

在審

• 申請號: 201610008311.1
• 申請日: 2016-01-07
• 公開（公告）號: CN105441477A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發明（設計）人: 張小紅;閔東紅;邵景俠;黎飛飛;趙雪晶;鄧艷芳;胡曉薇;田原;付金梅;喬夢;王曉東;普正菲
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明屬于基因工程育種技術領域，尤其涉及一種小麥花粉細胞電擊法轉化體系的優化方法，及利用這一方法在獲得抗逆轉基因小麥上的應用。

背景技術

小麥是主要的糧食作物之一，其總產量僅在玉米之下。到目前為止，我國培育小麥新品種主要是通過常規雜交育種的方法。但這種方法周期較長、可選擇范圍比較窄，而且其預見性比較差、性狀改良的效率也較低，因而延緩了小麥育種的發展進程。

與常規育種相比，分子育種縮短了育種的年限，為不同物種之間的遺傳交流提供了可能，彌補了常規育種的不足，得到了廣泛的利用和關注。隨著植物遺傳轉化技術的日益完善，利用轉基因技術有目的、精確的改良植物遺傳性狀創制轉基因新材料新品系已成為目前小麥育種的新方向。同時隨著小麥基因組測序工作的完成，大量基因將被克隆和進行功能研究。轉基因小麥研發和小麥功能基因組學研究需要獲得大量轉基因植株，迫切需要提高小麥轉化效率，擴大轉化規模，建立高效、安全、規模化轉基因技術體系，推進轉基因小麥產業化和小麥功能基因組學研究進程(葉興國等2014)。

普通小麥(TriticumaestivumL.)為六倍體植物基因組龐大，在主要農作物中，小麥屬于遺傳轉化比較困難的作物，轉化效率較低，重復性較差，轉化規模較小，優良轉基因材料較少，基因工程育種進程明顯落后于大豆、玉米、棉花、水稻等作物(葉興國等2014)。目前，應用于小麥的轉基因技術主要包括基因槍介導法和農桿菌介導法，有些實驗室也采用花粉管通道、離子介導、激光微束穿刺、PEG、花粉介導和農桿菌浸花等方法(葉興國等2014)。其中基因槍轉化法是小麥遺傳轉化中采用的最主要的轉化方法，絕大多數的轉化事件是由基因槍法轉化得到的。但基因槍轉化法依賴于組織培養再生途徑，組培程序復雜，材料的無菌轉接操作繁瑣，轉化過程對操作人員的操作技術水平要求較嚴；許多優良基因型再生困難；且基因槍法成本較高；轉化效率低而不穩，轉化效率一般在0～1％(葉興國等2011,2014)；轉化的外源基因拷貝數較多，易引起基因表達沉默；經過組織培養易產生無性系變異；而且再生植株有嵌合體現象；轉基因后代多為雜合狀態，純合時間較長，在自交純合過程中外源基因易丟失。農桿菌轉化法也需要通過組織培養途徑，成本較低且在雙子葉植物上已基本成熟，在單子葉植物小麥上隨著不斷地改進近年也有所進展，但在實際應用中仍存在小麥愈傷組織對農桿菌不敏感、侵染后愈傷組織極易褐化死亡，往往導致轉化失敗(葉興國等2011；張潔等2013)。花粉管通道法是利用植物自然授粉過程中花粉管伸入到子房中形成的花粉管通道，外源基因借助此通道進入胚囊，整合入受體植物基因組中完成轉基因過程。花粉管通道法不需要通過組織培養途徑，也是借助自然授粉受精過程進行基因轉化，成本低、不受植物種類限制，但是重復性和穩定性較差，現有報道其轉化率為0.135％(張立等2013)，轉化效率較低也不穩定。而其他的一些轉化方法如顯微操作、離子束介導法在小麥上目前應用也較為困難，效率低下，在小麥未見有成功的報道。超聲波花粉介導法是利用超聲波多次瞬時處理花粉導入外源基因，再通過授粉獲得轉基因植株，在油菜、玉米、芥菜等作物上已有轉化成功的報道，但在小麥轉基因中未見報道。

小麥的遺傳轉化難度大、效率低，已成為目前制約小麥轉基因研究發展的重要限制因素。因此，研究探索一種不依賴組織培養途徑、操作簡單、成本低、高效穩定的小麥遺傳轉化方法，對促進小麥轉基因研究具有重要的意義。

電擊法是將細胞置于高電場、低電容的環境中，利用高圧直流電給予細胞瞬時脈沖(微秒-毫秒)，使細胞膜瞬間被擊穿，產生微小孔洞，細胞膜出現通透性，引起一些分子、離子的運動與流動壓迫細胞膜，使其通透性增加，外源大分子或DNA的片段由這些孔洞進入細胞中(張有明等2004)。在適當的電場強度下，電擊后細胞膜上形成的孔洞是可逆的(張小娟等2011)，當外加電場消失后，被擊穿的細胞膜的脂質和蛋白質分子在維持極短時間后，可以重新排列恢復到原來的結構，細胞仍保持活力，外源遺傳物質隨著細胞的生長分化整合進受體細胞基因組。