[發明專利]一種用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法

在審

• 申請號: 201610008296.0
• 申請日: 2016-01-07
• 公開（公告）號: CN105586333A
• 公開（公告）日: 2016-05-18
• 發明（設計）人: 方文捷;洪南;陳敏;潘煒華;廖萬清;尤其敏;俞世沖;劉加;李娟;李穎芳;趙海霞;吳俊琪;孫剛
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學;杭州優思達生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12R1/645
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.一種用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、在2mlEP管中加入150-200mg酸洗玻璃微珠，加入真菌固體菌落；或在2mlEP管中加 入150-200mg酸洗玻璃微珠，加入菌液或者真菌感染組織液化標本，高速離心12000rpm/min 2分鐘，移液器盡量吸取上清；

B、加入300μl胍鹽裂解液；

C、金屬浴105℃加熱至裂解液溫度到達70-80℃；

D、迅速放入液氮冷凍30秒；

E、迅速放入金屬浴105℃加熱至裂解液溫度到達40-50℃；

F、組織破碎儀55Hz破碎60秒；

G、12000rpm/min離心一分鐘；

H、取200μl上清加入1.5mlEP管，加入20μl清洗液，充分混勻；

I、加入560μl無水乙醇，輕柔混勻；

J、取750μl混合液加入核酸吸附柱，10,000rpm/min離心一分鐘，棄離心液；

K、加入500μl洗脫液，10,000rpm/min離心一分鐘，棄離心液；

L、重復步驟K；

M、核酸吸附柱10,000rpm/min空轉2-3分鐘；

N、將吸附柱從收集管中取出，放入新的1.5mlEP管，在離心柱吸附膜中心加入60μl雙 蒸水或者TE緩沖液；

O、10,000rpm/min離心30秒收集DNA溶液。

2.根據權利要求1所述的用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在 于，所述的酵母樣真菌包括酵母菌和雙向真菌的酵母形態。

3.根據權利要求2所述的用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在 于，所述的酵母菌包括隱球菌、念珠菌、膠紅酵母、毛孢子菌，所述的雙向真菌的酵母形態包 括組織胞漿菌。

4.根據權利要求1所述的用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在 于，所述的步驟B中的胍鹽裂解液中異硫氰酸胍的濃度為4.0-5.5mol。

5.根據權利要求4所述的用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在 于，所述的步驟B中的胍鹽裂解液配方為：每1000ml裂解液中包含：三羥甲基氨基甲烷 0.047mol，乙二胺四乙酸二鈉0.020mol，異硫氰酸胍4.0-5.5mol，TritonX-10011.3ml，用 水補足1000ml，用鹽酸將pH調至6.53。

6.根據權利要求4所述的用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在 于，所述的胍鹽裂解液中異硫氰酸胍的濃度為4.7M。

7.根據權利要求1所述的用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在 于，所述的步驟H中的清洗液為：90％體積的無水乙醇加入10％體積的3MNaAC，所述的清洗 液的pH為5.2，用HAc調節pH值。

8.根據權利要求1所述的用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在 于，所述的步驟K中的洗脫液為雙蒸水或者TE緩沖液。

9.根據權利要求1所述的用于核酸擴增的酵母樣真菌總DNA快速提取方法，其特征在 于，所述的步驟B之后，加入工作濃度的蛋白酶K，在56℃消化一小時，再進行后續的液氮凍 融以及玻璃珠擊打步驟。