[發(fā)明專利]MSC促進(jìn)血管新生能力的定量方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610007156.1
• 申請日: 2016-01-06
• 公開（公告）號: CN105463058A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁璐;趙欽軍;韓之海
• 申請（專利權(quán)）人: 北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 北京國帆知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11334
• 代理人: 李增朝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，具體而言，涉及MSC促進(jìn)血管新生能力的 定量方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells,MSC)是一類源于中胚層 的異質(zhì)細(xì)胞群，可以從人體大多數(shù)組織獲取。它們具有自我更新能力、 組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)能力，可以向中胚層分化，例如：脂肪細(xì)胞、骨細(xì) 胞、軟骨細(xì)胞等，其中，胎盤和臍帶來源的MSC具有分化潛力大、增殖 能力強(qiáng)、免疫原性低、取材方便，沒有道德理論問題的限制、易于工業(yè) 化制備等特征，是最具臨床前景的多功能干細(xì)胞之一。

血管是人體的重要組成部分，它構(gòu)成了循環(huán)系統(tǒng)的主體。長期以來， 對于人自體血管內(nèi)皮細(xì)胞的各項(xiàng)研究絕大多數(shù)是基于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì) 胞(Humanvascularendothelialcell，HUVEC)。一方面，臍帶來源 豐富，容易獲取；另一方面，臍帶血管沒有分支，便于操作，而且臍帶 有著理想的長度，能夠保證細(xì)胞的足夠量。

MSC的促血管新生的特性對肢體缺血的治療有著非常重要的臨床意 義。但是目前缺乏評價MSC的促血管新生能力的方法，阻礙了MSC在治 療肢體缺血方面的臨床應(yīng)用。

本發(fā)明旨在建立一種MSC促進(jìn)血管新生能力的定量方法，對MSC促 進(jìn)血管新生能力進(jìn)行評價，以指導(dǎo)臨床應(yīng)用，保證MSC的療效。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一技術(shù)方案為一種MSC促進(jìn)血管新生能力的定量方法， 其特征在，建立共培養(yǎng)體系，

在該共培養(yǎng)體系中共培養(yǎng)MSC和內(nèi)皮細(xì)胞，其中，MSC通過因子分 泌的方式來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，

檢測所述內(nèi)皮細(xì)胞的增殖數(shù)量，

由所述內(nèi)皮細(xì)胞的增殖數(shù)量，對MSC的促血管新生能力進(jìn)行定量和 評價。

第二方案基于第一技術(shù)方案，其特征在于，所述內(nèi)皮細(xì)胞為HUVEC 細(xì)胞。

第三方案基于第二技術(shù)方案，其特征在于，還檢測VEGF因子，由 VEGF因子的數(shù)量對MSC的促血管新生能力進(jìn)行定量和評價。

第四方案基于第三技術(shù)方案，其特征在于，在建立共培養(yǎng)體系時， 確定孵育時間、共培養(yǎng)時間、MSC和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比例。

第五方案基于第四技術(shù)方案，其特征在于，所述孵育時間為2h、共 培養(yǎng)時間為72h、MSC和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比例為1/10。

第六技術(shù)方案基于第一至第五中的任一技術(shù)方案，其特征在于，在 建立共培養(yǎng)體系時，應(yīng)用不同來源的MSC與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，選擇 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖數(shù)量最少的MSC細(xì)胞，進(jìn)行移植治療，確認(rèn)其促血管 新生能力。

附圖說明

圖1示出了培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞；

圖2示出了CCK8孵育HUVEC細(xì)胞2h后標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3示出了CCK8孵育HUVEC細(xì)胞4h后標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖4示出了外源添加VEGF因子量與HUVEC細(xì)胞數(shù)之間標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖5示出了MSC和HUVEC共培養(yǎng)48h后HUVEC的增殖量；

圖6示出了MSC和HUVEC共培養(yǎng)72h后HUVEC的增殖量；

圖7示出了MSC/HUVEC不同比例促進(jìn)HUVEC的增殖；

圖8示出了MSC/HUVEC不同比例促進(jìn)HUVEC的增殖；

圖9示出了不同來源的MSC樣品促進(jìn)HUVEC的增殖；

圖10示出了激光多普勒檢測缺血下肢的血流灌注量，證明MSC在體 內(nèi)能夠促進(jìn)血管新生。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行說明，具體實(shí)施方案應(yīng) 該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不應(yīng)以下述舉例說明來限定本 發(fā)明的保護(hù)范圍。

本實(shí)施方式中，共培養(yǎng)體系中，在上腔中種植MSC，通過分泌因子而 不是直接接觸作用于下腔的HUVEC，促進(jìn)HUVEC的增殖，應(yīng)用CCK8試劑 盒檢測HUVEC的增殖數(shù)量，以此來衡量MSC促血管新生能力，評價其生 物學(xué)效力。

以下對MSC促血管新生能力的量化和評價進(jìn)行說明。在本實(shí)施方式 中，內(nèi)皮細(xì)胞采用HUVEC。具體方法如下：

(1)從臍帶中分離HUVEC細(xì)胞，在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培 養(yǎng)條件是37℃，5％CO₂。