[發明專利]2;4-二羥基丁酸的生產方法

有效

• 申請號: 201610007101.0
• 申請日: 2011-10-27
• 公開（公告）號: CN105505892B
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 托馬斯·瓦爾特;伊蓮娜·科迪爾;克里斯多夫·陶漢姆;伊莎貝爾·安德烈;馬加利·芮茂德-西蒙;羅伯特·胡艾特;讓-瑪麗·弗朗索瓦
• 申請（專利權）人: 安迪蘇法國聯合股份有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P7/42
• 代理公司: 北京市萬慧達律師事務所 11111
• 代理人: 吳曉輝;段曉玲

本發明涉及通過合成途徑生產2,4?二羥基丁酸(2,4?DHB)的方法，包括使用蘋果酸激酶將蘋果酸轉化為4?磷酸?蘋果酸，使用蘋果酸半醛脫氫酶將所述4?磷酸蘋果酸轉化為蘋果酸?4?半醛，并使用DHB脫氫酶將所述蘋果酸?4?半醛轉化為2,4?DHB。

本發明涉及通過使用合成途徑從蘋果酸生產2,4-二羥基丁酸的新方法，合成途徑包含分別具有蘋果酸激酶，蘋果酸半醛脫氫酶，和2,4-二羥基丁酸脫氫酶活性的酶。

本申請中引用的羧酸在其鹽(如2,4-二羥基丁酸鹽)或酸(如2,4-二羥基丁酸)形式下是等同命名的。

2,4-二羥基丁酸(等同2,4-DHB或DHB)是有相當經濟效益的化合物。通過調整適合的pH，可以在水介質中容易地將DHB轉化為α-羥基-γ-丁內酯。α-羥基-γ-丁內酯是生產在動物營養中有很大市場的甲硫氨酸物2-羥基-4-(甲硫基)-丁酸(HMTB)的重要前體(Decket al.,2008)。目前，α-羥基-γ-丁內酯通過包含γ-丁內酯在α位置的鹵化，并隨后在堿性介質中以羥基替代鹵素原子的多階段反應衍生自γ-丁內酯(Deck et al.,2008)。

由于油價的增長，從可再生資源生產DHB的需要升高。微生物能夠將源自生物質的原料，如糖或有機酸，轉化為大量各種不同的化學化合物(Werpy&Petersen，2004)。隨著生物化學和基因組學信息量的增長，可以修飾微生物以使其能以高產量和產率過量生產天然發生的代謝中間體(Bailey,1991)。生產微生物的優化經常需要合理的代謝網絡工程，這確保其中目標代謝物的生物合成所需的酶過量表達，并減輕產物的反饋抑制。另外的可能性是使用能催化目標代謝物生產的新酶系統。

代謝工程方法和酶催化需要生化和產生目標代謝物的代謝途徑調節方面的詳細知識。在生產DHB的情況下，這些信息是無法獲得的。僅有少量研究報道了琥珀酸半醛脫氫酶缺乏癥患者中的DHB發生(Shinka et al.2002)，然而沒有確定DHB生產中涉及的酶反應。因此，DHB的發酵或酶生產需要(i)確定能將易得到的前體轉化為DHB的熱力學可行途徑，(ii)確定或構建途徑中能夠催化各反應步驟的酶和(iii)在適合的生物生產中，途徑酶的功能表達。

本發明目的是為滿足這些需求。

因此，本發明的一個目的是生產2,4-DHB的方法，包括使用蘋果酸激酶將蘋果酸轉化為4-磷酸-蘋果酸的第一步驟，使用蘋果酸半醛脫氫酶將4-磷酸-蘋果酸轉化為蘋果酸-4-半醛的第二步驟，使用DHB脫氫酶將蘋果酸-4-半醛轉化為2,4-DHB的第三步驟。

在第一個反應中(見圖1(i))，通過具有蘋果酸激酶活性的酶的作用，蘋果酸(1)被轉化為4-磷酸-蘋果酸(2)(A)。在第二個反應(B)中，通過具有蘋果半醛脫氫酶活性的酶的作用，4-磷酸-蘋果酸被轉化為蘋果酸-4-半醛(3)。更準確地，反應(B)是由在生物合成途徑意義中具有脫磷酸4-磷酸-蘋果酸還原酶活性的酶來催化。在第三反應(C)中，通過具有DHB脫氫酶活性的酶的作用，蘋果酸-4-半醛被轉化為DHB。更準確地，反應(C)是由在生物合成途徑意義中具有蘋果酸-4-半醛還原酶活性的酶來催化。

目前為止在活細胞中既沒有描述過也沒有確認過上面引用的酶和中間產物。這樣蘋果酸激酶，蘋果酸半醛脫氫酶，DHB脫氫酶和4-磷酸-蘋果酸是本發明進一步的目的。

在本發明另外一個方面中，生產2,4-DHB方法的第一步驟包括蘋果酸激酶，其特征在于其能將蘋果酸轉化為4-磷酸-蘋果酸。所述酶可以通過酶的至少一個突變獲得，所述突變改進了突變酶對蘋果酸的活性和/或底物親和力。

在本發明中，表述“改進活性和/或底物親和力”意思是突變前的酶，要么是

-不能使用底物(蘋果酸，4-磷酸-蘋果酸或蘋果酸-4-半醛)，和/或