[發(fā)明專利]快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中高致病病原微生物的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610006603.1
• 申請日: 2016-01-04
• 公開（公告）號: CN105441570A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫海君
• 申請（專利權(quán)）人: 孫海君
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 北京捷誠信通專利事務(wù)所(普通合伙) 11221
• 代理人: 王衛(wèi)東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及鮑魚養(yǎng)殖，具體涉及快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中高致病病原微生物的方法。

背景技術(shù)

鮑魚肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，其由于富各種含氨基酸、維生素及人體必需的多種微量元素和礦物質(zhì)，被譽為海味八珍之冠。除了營養(yǎng)外，近代醫(yī)學(xué)家也認(rèn)為鮑魚有滋補強壯之效，有溫補肝腎、益精明目、滋陰清熱、可明目和降血壓，故鮑魚即是豐盛宴席上的美味，也是食物療法中佳肴，同時有研究表明從鮑魚提取的多糖具有很好的抗腫瘤、提高免疫力等作用。鮑殼是著名的中藥“石決明”，有平肝潛陽，清肝明目的功效，是治療高血壓，頭昏、肝硬化的良藥，臨床上常用其代替羚羊角。

20世紀(jì)中期鮑魚的自然捕獲量每年僅有200至200噸，70年代廣東省進(jìn)行鮑魚的人工養(yǎng)殖和幼苗實驗并獲得成功，80年代作為重點推廣性生產(chǎn)，開始被逐步推廣，近幾年來，隨著鮑魚養(yǎng)殖技術(shù)的日趨成熟，我國鮑魚的人工養(yǎng)殖發(fā)展速度驚人，人工養(yǎng)殖的規(guī)模不斷擴大，已經(jīng)成為世界大型的鮑魚養(yǎng)殖國。

隨著鮑魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，密集養(yǎng)殖程度日益增強，養(yǎng)殖環(huán)境的逐步惡化，各種病害頻繁發(fā)生，如膿鮑病、“掉板癥”等，導(dǎo)致許多養(yǎng)鮑場嚴(yán)重虧損甚至倒閉，成為制約鮑魚養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的重要制約因素，其中，病原微生物被認(rèn)為是導(dǎo)致養(yǎng)殖鮑魚高死亡率的重要因素鮑魚養(yǎng)殖遇到的各種病害，如大連地區(qū)1993年夏季發(fā)生了河流弧菌引起皺紋盤鮑的“膿鮑病”；2000年東山縣爆發(fā)性流行鮑病由溶藻弧菌和副溶血弧菌共同作用導(dǎo)致；2006年周晶等人研究發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌是導(dǎo)致南方雜色鮑幼苗大規(guī)模死亡(業(yè)內(nèi)稱之為“掉板癥”)的致病菌；2011年王智等人從九孔鮑苗病體上分離出的病原菌為溶藻弧菌。

結(jié)合以往的報道和研究發(fā)現(xiàn)，鮑魚細(xì)菌性疾病多數(shù)由溶藻弧菌、副溶血弧菌和河流弧菌引起，而且，有些細(xì)菌如副溶血弧菌還可以導(dǎo)致人類的疾病。因此，如何快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中的高致病病原微生物對于鮑魚的人工養(yǎng)殖具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中的高致病病原微生物的問題。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中高致病病原微生物的方法，包括以下步驟：

確定鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中存在治病風(fēng)險且需及時處理，以及無治病風(fēng)險需但進(jìn)一步監(jiān)測的菌限值；

收集鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境水樣，并提取所收集水樣中全部病原菌DNA；

利用溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種特定引物對樣品中病原菌的總DNA進(jìn)行熒光定量PCR測定，獲得所收集水樣中是否存在上述三種病原菌或者病原菌總量是否超過設(shè)定的菌限值，以此判斷所收集水樣是否存在病原微生物的威脅。

在上述方法中，用于檢測溶藻弧菌的引物為：

F-引物，5-GTCGGATTCAAGAGTCGGTATT-3；

R-引物，5-TAACCCGCGCGTAAGTATAAG-3；

片斷長度AmpliconLength＝136bp；

解鏈溫度Tm＝60；

用于檢測河流弧菌的引物為：

F-引物，5-CTCAAGCCATCTCAACCCTAC-3；

R-引物，5-CGGTCGCGATCAACTGATAA-3；

片斷長度AmpliconLength＝102bp；

解鏈溫度Tm＝60；

用于檢測副溶血弧菌的引物為：

F-引物，5-CTGATAACTTGCCGGACGATAC-3；

R-引物，5-GTTTGCCACGCGAATGTAATC-3；

片斷長度AmpliconLength＝101bp；

解鏈溫度Tm＝60。

在上述方法中，利用鮑魚在養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌半數(shù)致死量的測定結(jié)果，確定鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中存在治病風(fēng)險且需及時處理，以及無治病風(fēng)險需但進(jìn)一步監(jiān)測的菌限值。

在上述方法中，提取水樣中全部微生物的DNA的方法如下：

使用10um無菌濾膜將收集到的鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境的水樣過濾，去除固體雜質(zhì)及真菌，再利用0.22um無菌濾膜過濾水樣，把水樣中的細(xì)菌微生物全部固定在0.22um濾膜上；

收集0.22um濾膜，用無菌剪刀剪碎置放入50ml無菌離心管中，添加生理鹽水，充分振蕩，然后收集濾膜上的微生物；