[發(fā)明專利]一種檢測(cè)診斷遺傳性心肌病致病基因的DNA文庫及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610004044.0
• 申請(qǐng)日: 2016-01-05
• 公開（公告）號(hào): CN105506115B
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪道文;李宗哲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京中政聯(lián)科專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11489
• 代理人: 謝磊

本發(fā)明公開一種通過靶向高通量半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)檢測(cè)遺傳性心肌病致病基因突變的DNA文庫及其應(yīng)用。具體來說，根據(jù)80個(gè)遺傳性心肌病致病基因，設(shè)計(jì)引物池，對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行超多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用高通量半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，尋找致病突變，為臨床診斷提供遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論依據(jù)。本發(fā)明具有準(zhǔn)確、快速、靈活、低成本的特點(diǎn)，本發(fā)明涉及的80個(gè)基因檢測(cè)區(qū)域能夠檢測(cè)肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病、左室心肌致密化不全心肌病五大類常見的遺傳性心肌病，對(duì)遺傳性心肌病的診斷和鑒別診斷有著重要的意義和臨床價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種通過靶向高通量半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)檢測(cè)診斷遺傳性心肌病致病基因的DNA文庫及其應(yīng)用。具體說是根據(jù)遺傳性心肌病致病基因，設(shè)計(jì)能覆蓋上述基因外顯子及毗鄰區(qū)域的超多重PCR引物，并對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行超多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，尋找致病突變，明確遺傳性心肌病的遺傳學(xué)病因，為臨床診斷提供遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論依據(jù)，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測(cè)技術(shù)中的基因檢測(cè)技術(shù)。

背景技術(shù)

遺傳性心肌病是一組以心肌直接受累為主要特征的疾病，主要包括：肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病和左室心肌致密化不全心肌病五大類，其病程常伴隨心力衰竭和心律失常。遺傳性心肌病患者最終可能面臨心臟移植、猝死等重大風(fēng)險(xiǎn)，并且可能將疾病遺傳給下一代，給家庭和社會(huì)帶來巨大的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。遺傳性心肌病是遺傳病，其發(fā)病是由于基因突變所導(dǎo)致，但是其涉及致病基因數(shù)量多,同一種疾病致病基因不同造成的預(yù)后差別懸殊,基因型與疾病表型之間異質(zhì)性高，故早期進(jìn)行精確診斷，進(jìn)而選擇恰當(dāng)治療方案進(jìn)行個(gè)性化治療極為重要。

目前，研究發(fā)現(xiàn)遺傳性心肌病的眾多致病基因中，只要任意一種基因發(fā)生功能性突變，即可引起疾病表型，即：同一種遺傳性心肌病可以由多種遺傳因素所導(dǎo)致。并且，不同基因的突變導(dǎo)致的同一種遺傳性心肌病，其嚴(yán)重程度和預(yù)后有著較大差異。例如：MYBPC3基因突變導(dǎo)致的僅以心肌輕度肥厚為特點(diǎn)的肥厚型心肌病患者預(yù)后較好，通常不會(huì)發(fā)生嚴(yán)重心律失常或猝死的并發(fā)癥，僅需藥物治療或隨訪觀察即可；而PRKAG2基因突變導(dǎo)致的肥厚型心肌病患者多伴發(fā)WPW綜合征，有很高的猝死風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)考慮行ICD植入術(shù)。除此之外，同一患者如果攜帶了一個(gè)以上的致病基因突變，其臨床表現(xiàn)和預(yù)后與只攜帶單一致病突變的患者相比會(huì)有差異。因此，全面、快速、準(zhǔn)確地篩查致病基因是遺傳性心肌病精確診斷和個(gè)性化治療的必須前提條件。

臨床上現(xiàn)有的遺傳性心肌病的常規(guī)診斷技術(shù)，主要包括影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查兩大類。影像學(xué)檢查包括心臟彩超、心臟CT和心臟核磁共振。這些技術(shù)可以較為準(zhǔn)確地判斷心室壁厚度，心腔大小和心肌運(yùn)動(dòng)情況等客觀指標(biāo)，粗略判斷患者是否患有遺傳性心肌病。但是，影像學(xué)檢查不能精確、特異地區(qū)別遺傳性心肌病的具體種類，分子亞型，不能對(duì)患者預(yù)后做確切判斷，也不能在早期尚未表現(xiàn)出臨床癥狀的情況下對(duì)患者進(jìn)行診斷。實(shí)驗(yàn)室檢查主要包括傳統(tǒng)生化指標(biāo)的檢測(cè)，如：心肌肌鈣蛋白、心房鈉尿肽等，僅能反映心臟損傷，不能對(duì)遺傳性心肌病的分類提供幫助。因此，目前僅結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)及傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查有時(shí)不能把遺傳性心肌病很好區(qū)分。對(duì)于特殊類型的心肌病，如：糖原蓄積病或線粒體心肌病可能需要進(jìn)行心肌活檢來進(jìn)行確診，患者所受痛苦較大。而使用基因診斷的方法來替代穿刺活檢進(jìn)行鑒別診斷則可避免這種痛苦。同時(shí)，傳統(tǒng)的基于Sanger測(cè)序的基因檢測(cè)方法存在通量低的弊端，一次反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)擴(kuò)增區(qū)域，無法滿足龐大的基因檢測(cè)區(qū)域和多樣本檢測(cè)時(shí)效性的要求。

因此，有必要尋求一種新的檢測(cè)遺傳性心肌病致病基因突變的方法，提高診斷準(zhǔn)確率，降低成本和勞動(dòng)強(qiáng)度并提高時(shí)效性。

發(fā)明內(nèi)容