[發明專利]一種腫瘤抑制蛋白變體DV398及其應用

有效

• 申請號: 201610003729.3
• 申請日: 2014-05-15
• 公開（公告）號: CN105504040A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 馬恒標
• 申請（專利權）人: 馬恒標
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及腫瘤抑制蛋白變體。

背景技術

腫瘤相關蛋白DENND2D-v2，由468個氨基酸殘基組成，自序列4的氨基末端第47至 145位氨基酸殘基為uDENN結構域，自序列4的氨基末端第146至330位氨基酸殘基為DENN結 構域，自序列4的氨基末端第368至435位氨基酸殘基為dDENN結構域。該腫瘤相關蛋白在小 鼠成纖維細胞內穩定高表達可以明顯抑制該細胞的惡性轉化；在mRNA水平檢測其在細胞系 中的表達結果表明，肺癌細胞系中的表達水平顯著低于原代培養的正常支氣管上皮細胞； 在肺癌臨床組織標本中檢測其表達水平結果表明，肺癌組織的表達水平明顯低于其周邊的 正常組織。該腫瘤相關蛋白可用于腫瘤的體外診斷、預后。含有上述腫瘤相關蛋白編碼基因 的重組真核表達載體在導入肺癌細胞系中后，能單獨引起肺癌細胞系的生長變緩及致瘤性 減弱。因此，該蛋白具有較好的腫瘤藥物應用前景。

在現有技術中，為了提高蛋白的活性，針對蛋白的活性位點進行特異性的突變和 取代，從而尋找活性更高的變體是常規的做法。為了進一步提高該蛋白的生物活性，申請人 通過大量的實驗，針對DENND2D-v2氨基酸序列中特定的位點進行了點突變，從而獲得了比 DENND2D-v2蛋白本身具有更高抑制活性的變體。

發明內容

本發明涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個對應于SEQIDNO:1的成熟多 肽的位置53Y、60K、70P、79R、92R、97I、109A、131K、141A、204S、225E、232L、253K、270A、271A、 297C、305G、322V、347L、379F、398Q、433Q或451L的位置包含修飾。具體而言，本發明的變體 具有改善的抑制活性。

優選地，應用于本發明的方法、呈現改善的抑制活性的蛋白變體包含至少1種任一 下述修飾：53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、 225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、 433Q/S、451L/V。

本發明還涉及產生本發明的蛋白變體的方法，包括(a)培養宿主細胞；和(b)回收 所述蛋白變體。

在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合于產生所述多肽的營養培 養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下 進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規?；虼笠幠０l酵(包括連續、分批、補料 分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所 述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據 公開的組成制備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養 基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物 (lysate)回收。

所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養 培養基中回收，所述常規方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀。

本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析 (例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型 (preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見，例如， ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden編,VCHPublishers,NewYork,1989)。

本發明的多肽用于制備相應的藥物，去用于治療癌癥。

具體實施方式

實施例1：DENND2D-v2基因的獲得

DENND2D-v2：

上游引物5’CACTCCAGGGGCCATGGATG3’

下游引物5’GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3’

用上述引物，以人正常肺組織cDNA文庫(Clontech：K1420-1)為模板進行PCR擴增 反應，反應條件如下：

反應體積50μl，其中含有：