[發明專利]一種植酸酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 201610003132.9
• 申請日: 2016-01-04
• 公開（公告）號: CN105567656A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 黃遵錫;苗華彪;韓楠玉
• 申請（專利權）人: 昆明愛科特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N1/19;C12N15/81;A23K20/189;C12R1/84
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，尤其涉及一種植酸酶突變體及其應用。

背景技術

植酸廣泛存在于玉米、米糠、各種餅粕等飼料原料中，一方面它具有很強 的抗營養作用，與飼料中金屬離子和蛋白質結合，影響這些營養物質的消化與 吸收；另一方面植酸分子含有大量有機磷，動物胃腸道由于缺少相應的酶，因 而不能利用，這些有機磷隨糞便排放到環境中，造成環境污染。植酸酶可使植 酸發生水解反應，生成肌醇衍生物和正磷酸，作為單胃動物的飼料添加劑，可 以促進動物對磷元素的利用，有助于畜禽生長，提高畜牧業效益，同時它還能 降低植酸磷對環境的污染，并且可以提高飼料中能量與蛋白質的消化率。現在 已成為飼料行業公認的有效飼料添加劑。植酸酶作為飼料添加劑在實際應用過 程中需要耐受飼料高溫制粒過程，因此飼用植酸酶必須耐熱，而目前大多數植 酸酶耐熱性能較差。

無花果植酸酶(黑曲霉植酸酶)雖然酶比活相對高，也具有一定的耐熱作 用，但在實際應用上還不理想，如果能夠將其耐熱性增高，無花果植酸酶將具 有更大的應用價值。相比之下，煙曲霉植酸酶有著更好的耐熱性，但比活相對 較低。因此，本發明根據煙曲霉植酸酶的序列中與其耐熱性相關的氨基酸序列 來改造無花果曲霉植酸酶，使其成為耐熱性高的植酸酶。

發明內容

本發明的目的在于提供一種植酸酶突變體及其應用，旨在解決無花果植酸 酶的耐熱性較差，在實際應用上不理想的問題。

本發明是這樣實現的，通過定點突變的方法將編碼無花果曲霉(黑曲霉) 植酸酶氨基酸序列SEQIDNO：3中的氨基酸發生如下改變A39E,N40D,S42L, V43S,I44V,P46S,R167G,Q169T,P170N,G171R,Q172A,T252R,S253T,T254S, V255D,D256A,T257S,K258Q獲得一種新的植酸酶突變體，所述植酸酶突變體 的氨基酸序列SEQIDNO：1；所述植酸酶突變體的核苷酸序列SEQIDNO：2。

本發明的另一目的在于提供一種所述植酸酶突變體在飼料添加劑中的應 用。

本發明的另一目的在于提供一種如所述植酸酶突變體的獲得方法，所述植 酸酶突變體的獲得方法包括：

原來無花果植酸酶基因連接到ppic9k載體上的重組質粒為模板，進行突變 PCR擴增；PCR體系按照試劑盒說明書配制50μL；

取10μlPCR產物，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。條帶正確后加1μlDMT酶 于PCR產物中，混勻，37℃孵育1h；

然后轉化，加入2-5μlDMT酶消化產物于50μlDMT感受態細胞中，輕彈 混勻，冰浴30分鐘；42℃準確熱激45秒，立即置于冰上10min；加500μlLB 培養基，200轉，37℃培養1小時；7000rpm離心3min，棄掉部分上清，保留 100-150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養過夜；

驗證陽性克隆子，每個位點的陽性克隆送出測序，測序結果與原序列比對， 找出突變正確的重組質粒，再以突變一次質粒作為模板，進行第二位點突變至 止突變位點全部突變掉，突變后的質粒轉入畢赤酵母GS115或(X33、SMD1168、 PICHIAPINK)中進行表達，發酵測酶活，研究酶學及應用特性。

進一步，所述PCR反應參數為：94℃預變性5min；94℃變性30S，66℃ 退火30S，72℃延伸3min30S，共28個循環；94℃變性30S，52℃退火30S，72℃ 延伸3min30S，共7個循環；72℃擴增后延伸10min；其中從66℃到52℃每個 循環溫度下降0.5℃。

進一步，所述植酸酶突變體的酶促反應最適pH值為6.0；最適溫度為50℃； 在pH2、37℃條件下，pH耐受1小時，殘活還在60％左右，在pH5、37℃條件 下，pH耐受1小時，殘活還在90％以上。植酸酶在70℃耐受5min、80℃時耐 受3min、高溫90℃時耐受1min,殘活都在80％以上。