[發明專利]一種DNA片段體外組裝方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201580083695.7
• 申請日: 2015-10-21
• 公開（公告）號: CN108138189B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 陳泰;趙宏翠;范楚珧;陳世宏;王云;沈玥;徐訊
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院
• 主分類號: C12N15/64
• 分類號: C12N15/64;C12N15/10;C12N15/66;C12P19/34
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

一種DNA片段體外組裝方法和試劑盒，能夠將多個DNA片段和組裝載體按照設定的順序組裝起來，其中第一個片段上游和最后一個片段下游分別帶有與組裝載體相同的重疊序列，其它片段上游帶有與上一個片段下游相同的重疊序列，下游帶有與下一個片段上游相同的重疊序列；組裝載體的重疊序列的內側任選地分別帶有酶切位點，任選地在酶切位點之間帶有篩選標記；本發明的方法使多個DNA片段和組裝載體與DNA內切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶進行反應，實現組裝。

技術領域

本發明涉及DNA組裝技術領域，尤其涉及一種DNA片段體外組裝方法和試劑盒。

背景技術

DNA化學合成方法雖然可以從頭合成一定長度的DNA序列，但是更大片段的DNA合成則必須要通過DNA組裝來完成，所以DNA組裝技術就成了合成生物學和代謝工程等領域最重要的基礎實驗技術之一。最早的DNA組裝采用的是酶切、連接的方法。酶切、連接的方法經過了幾十年的發展，不斷得到擴展和完善，是基因工程領域最為經典的基礎實驗方法之一。如BioBrick方法，只需重復使用4種標準化的限制性內切酶就可以將各種基因元件依次連接到標準載體上，是酶切、連接方法的重要分支之一。酶切、連接方法的另外一個分支——Golden Gate，可以通過酶切、連接一步同時反應將一個或多個線型或環狀雙鏈DNA片段組裝并連接到組裝載體上，也是比較常用的組裝方法之一。但是酶切、連接的方法仍然有一些無法克服的缺陷，如酶切位點的限制，連接的片段數量、長度的限制等。

隨著合成生物學的發展，尤其是隨著基因組人工合成領域的發展，人們對于DNA大片段的需求量極速增加，常規酶切、連接的方法就顯得力不從心了。因此近年來又逐漸發展出了很多新的DNA組裝技術，其中以利用同源序列進行組裝的方法最為常見，形成了一系列體內、體外不同的組裝方法，都可以有效的對多個任意的DNA片段進行組裝，擺脫了酶切位點的限制。同源區體外組裝方法如CPEC、USER、SLIC、Gibson組裝等，這些方法都可以利用片段之間的一段同源序列，將多段雙鏈DNA片段有效地連接起來，只是產生同源粘性末端的方式各不相同。其中尤其以Gibson組裝方法最為方便，適用范圍廣，可以通過一步組裝反應將多個帶有同源區的雙鏈線性DNA片段組裝成一個雙鏈線性DNA大片段。Gibson組裝還可以實現多個單鏈DNA片段的組裝和克隆。但Gibson組裝一步拼接法合成費用高，拼接效率低。另外，利用同源單鏈DNA橋實現連接的組裝方法LCR、利用酵母同源重組系統進行組裝的酵母體內組裝方法等也是DNA多片段組裝的有效方法，且這兩種方法是目前組裝效率最高的方法。

但是現有方法仍然不夠完美，更高的組裝效率、更低的錯誤率、更簡單快速的操作流程仍然是人們在DNA組裝技術開發上不斷追求的目標。

發明內容

本發明提供一種依賴于重疊序列的DNA片段體外組裝方法，可完成多個DNA片段的組裝和克隆。相應地，本發明還提供用于DNA片段體外組裝的試劑盒。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種DNA片段體外組裝方法，包括將多個DNA片段和組裝載體組裝起來的步驟；其中上述多個DNA片段按照設定的片段順序，第一個片段上游和最后一個片段下游分別帶有與上述組裝載體相同的重疊序列，其它片段上游帶有與上一個片段下游相同的重疊序列，并且其它片段下游帶有與下一個片段上游相同的重疊序列；上述組裝載體包括兩個重疊序列，任選地其內側分別帶有酶切位點，任選地在酶切位點之間帶有篩選標記；上述方法使上述多個DNA片段和上述組裝載體與識別上述酶切位點的DNA內切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶接觸進行反應，將上述多個DNA片段按照設定的組裝順序組裝到上述組裝載體上。