[發明專利]真菌基因組修飾系統及使用方法

在審

• 申請號: 201580076187.6
• 申請日: 2015-12-15
• 公開（公告）號: CN107667171A
• 公開（公告）日: 2018-02-06
• 發明（設計）人: B·S·鮑爾;J·陳;葛晶;X·顧;S·M·馬德里;D·宋;M·宋;M·沃德
• 申請（專利權）人: 丹尼斯科美國公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/10;C12N15/113;C12N15/80
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所11247
• 代理人: 張莉,黃革生

1.一種用于使供體DNA與絲狀真菌細胞中的基因組座位進行同源重組的方法，該方法包括：

a)向絲狀真菌細胞的群體中引入Cas內切核酸酶、指導RNA以及包含與該真菌細胞的基因組座位具有同源性的區域的供體DNA，其中該Cas內切核酸酶和指導RNA能夠形成使得該Cas內切核酸酶能夠在這些真菌細胞的基因組座位中或附近的靶位點處起作用的復合物；并且

b)從該群體中鑒定其中該供體DNA與該基因組座位已經發生了同源重組的至少一個真菌細胞，

其中該Cas內切核酸酶、該指導RNA或兩者被瞬時地引入該真菌細胞的群體中。

2.如權利要求1所述的方法，其中在這些真菌細胞中的靶位點處的非同源末端連接(NHEJ)機制是未激活的、無功能的或減弱的。

3.如權利要求2所述的方法，其中在這些真菌細胞中的非同源末端連接(NHEJ)途徑包含一種或多種無功能的或活性降低的組分。

4.如權利要求3所述的方法，其中該一種或多種無功能的或活性降低的組分選自下組，該組由以下各項組成：ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4、xrs及其組合。

5.如權利要求4所述的方法，其中該一種或多種無功能的或活性降低的組分是ku80。

6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該Cas內切核酸酶是Cas切口酶。

7.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中該Cas內切核酸酶是Cas9內切核酸酶或其變體。

8.如權利要求7所述的方法，其中該Cas9內切核酸酶或其變體包含來自選自下組的物種的全長Cas9或其功能片段，該組由以下各項組成：鏈球菌屬物種(Streptococcus sp.)，化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、變異鏈球菌(S.mutans)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)；彎曲桿菌屬物種(Campylobacter sp.)，空腸彎曲桿菌(C.jejuni)；奈瑟氏菌屬物種(Neisseria sp.)，腦膜炎奈瑟球菌(N.meningitides)；弗朗西斯氏菌屬物種(Francisella sp.)，新兇手弗朗西斯菌(F.novicida)；巴斯德氏菌屬物種(Pasteurella sp)；以及巴斯德氏菌屬(Pasteurella sp)物種，多殺巴斯德菌(P.multocida)。

9.如權利要求8所述的方法，其中該Cas9內切核酸酶或其變體包含與SEQ ID NO:45和48至53中任一項具有至少70％同一性的氨基酸序列。

10.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該供體DNA包含目的多核苷酸序列，并且其中在該基因組座位處的同源重組導致將該目的多核苷酸序列插入該基因組座位中。

11.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該引入步驟包括將包含該Cas內切核酸酶的表達盒的DNA構建體引入這些真菌細胞中。

12.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該引入步驟包括將包含該指導RNA的表達盒的DNA構建體引入這些真菌細胞中。

13.如前述權利要求中任一項或權利要求48-54中任一項所述的方法，其中該引入步驟包括向這些真菌細胞中引入包含編碼可選擇標記的序列的DNA構建體。

14.如權利要求13所述的方法，其中該DNA構建體包含編碼該可選擇標記的序列和該供體DNA兩者。

15.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該引入步驟包括向這些真菌細胞中引入DNA構建體，該DNA構建體包含：編碼該Cas內切核酸酶的序列、編碼該指導RNA的序列、編碼可選擇標記的序列和該供體DNA。

16.如權利要求11至15中任一項所述的方法，其中該DNA構建體是線性DNA構建體。

17.如權利要求11至15中任一項所述的方法，其中該DNA構建體是環狀DNA構建體。

18.如權利要求11和15-17中任一項所述的方法，其中該Cas內切核酸酶的表達盒或編碼該Cas內切核酸酶的序列包含為了在該絲狀真菌細胞中表達而優化的Cas編碼序列。