[發明專利]真菌基因組修飾系統及使用方法

在審

• 申請號: 201580076181.9
• 申請日: 2015-12-16
• 公開（公告）號: CN107278231A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 葛晶;X·顧;S·M·馬德里;D·宋;M·宋;M·沃德
• 申請（專利權）人: 丹尼斯科美國公司
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/55
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所11247
• 代理人: 胡志君,黃革生

1.一種用于在真菌細胞的基因組中的靶位點處插入供體DNA的方法，該方法包括：

a)向真菌細胞的群體中引入Cas內切核酸酶、指導RNA和供體DNA，其中該Cas內切核酸酶和指導RNA能夠形成復合物，該復合物使該Cas內切核酸酶能夠在所述真菌細胞的基因組的基因組座位中的靶位點處引入雙鏈斷裂；并且

b)從該群體中鑒定在該基因組座位中的該靶位點處已經發生了該供體DNA的插入的至少一個真菌細胞，

其中該Cas內切核酸酶、該指導RNA或兩者都被瞬時地引入該真菌細胞的群體中。

2.如權利要求1所述的方法，其中該插入不是經由該供體DNA與所述真菌細胞的基因組之間的同源重組發生的。

3.如權利要求1或2所述的方法，其中該供體DNA不包含與該基因組座位中的基因組序列同源的序列。

4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該供體DNA的插入中斷該基因組座位的表達或功能。

5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該供體DNA包含目的基因。

6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該供體DNA包含編碼目的基因產物的表達盒。

7.如權利要求6所述的方法，其中該目的基因產物是目的蛋白質。

8.如權利要求6所述的方法，其中該目的基因產物是表型標記。

9.如權利要求8所述的方法，其中該表型標記選自下組，該組由以下各項組成：營養缺陷型標記、抗生素抗性標記、顯性異源可選擇標記和報告基因。

10.如權利要求1、2和4-9中任一項所述的方法，其中該供體DNA包含與在該基因組座位中的基因組序列同源的序列，其中該基因組序列和該靶位點位于基因組缺失靶標區域側翼，并且其中該供體DNA的插入導致該基因組序列以及與該基因組序列同源的序列位于包含該基因組缺失靶標區域的環出靶標區域的側翼。

11.如權利要求10所述的方法，該方法進一步包括：

c)在允許該環出靶標區域環出的條件下培養該至少一個經鑒定的真菌細胞，并且

d)在培養物中鑒定該環出靶標區域已經發生了環出的至少一個真菌細胞。

12.一種用于在真菌細胞的基因組中使靶標區域缺失的方法，該方法包括：

a)向真菌細胞的群體中引入Cas內切核酸酶、指導RNA和供體DNA，其中該Cas內切核酸酶和指導RNA能夠形成使得該Cas內切核酸酶能夠在所述真菌細胞的基因組中的靶位點處引入雙鏈斷裂的復合物，并且允許該供體DNA被插入在該靶位點處，其中該供體DNA包含與所述真菌細胞的基因組序列同源的序列，并且其中該基因組序列和該靶位點位于該真菌細胞基因組中的靶標區域的側翼；

b)在允許該基因組序列以及與該基因組序列同源的序列之間進行同源重組的條件下培養該真菌細胞的群體；并且

c)在培養物中鑒定已經發生了該靶標區域的缺失的至少一個真菌細胞；

其中該Cas內切核酸酶、該指導RNA或兩者都被瞬時地引入該真菌細胞的群體中。

13.如權利要求12所述的方法，該方法進一步包括：在步驟a)和b)之間從該群體中鑒定在該靶位點處已經發生了該供體DNA的插入的至少一個真菌細胞的步驟。

14.如權利要求12或13所述的方法，其中該供體DNA不是經由該供體DNA和該真菌細胞基因組之間的同源重組插入該靶位點處的。

15.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中該Cas內切核酸酶是II型Cas9內切核酸酶或其變體。