[發明專利]估計DNA芯片探針-靶親和性的方法和制造DNA芯片的方法

有效

• 申請號: 201580074888.6
• 申請日: 2015-11-30
• 公開（公告）號: CN107533588B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: J·貝克爾;P·佩羅;F·馬萊
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃公司;里昂公立收容所
• 主分類號: G16B25/00
• 分類號: G16B25/00;G16B25/20
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 王健;林曉紅

一種估計第一DNA鏈或“探針”與第二DNA鏈或“靶”雜交形成長度為L_bp的雜交體的親和性φ的方法，所述方法包括：在雜交體的一組M個分區的每一分區內，計數一組P個DNA鏈雜交體的每一雜交體存在于所述分區中的次數，所述雜交體長度為k，小于長度L_bp，或是“k?雜交體”；對于長度為L_bp的雜交體中一組L個錯配組合的每一錯配組合，確定所述錯配對是否存在于所述雜交體中；和根據以下關系式計算親和性φ：該表達式中：是當P個k?雜交體組的第p個k?雜交體存在于所述分區的第m個區域時，定量此第p個k?雜交體對親和性φ的貢獻的預定標量，且x_m，p是這第p個k?雜交體在所述分區的第m個區域中被計數的次數；和α是實數項。

本發明涉及轉錄物組領域，尤其是DNA鏈之間的雜交研究。

本發明特別用于設計雜交支持物的領域，尤其是DNA芯片。

技術領域

DNA芯片測量轉錄物表達水平，這是根據簡單DNA鏈與互補DNA鏈一起時自發重新形成雙鏈的性質，即其與互補鏈雜交的性質。為了解生物樣品中的轉錄物表達水平，DNA芯片包括含氮堿基的序列，稱為“探針”，其設計成與一組感興趣轉錄物或“靶”轉錄物特異雜交。為提高測量的穩健性，轉錄物由數個探針靶向，共同形成“探針組”。出于高速篩選的目的，DNA芯片因而包括靶向I個轉錄物的I個“探針組”，總共J個不同探針。出于測量目的，每一探針同樣重復大量次數，重復的探針布置在孔中。

尋求表達的靶轉錄物能產生數千個或數以萬計的含氮堿基A、G、C、T，其首先通過擴增過程轉化成含較小DNA片段的溶液，所述片段長度通常為25-200個含氮堿基，由熒光著色劑標記。如此獲得的溶液隨后沉積于DNA芯片孔中。每一孔對應于重復數次并針對轉錄物設計的探針，這因而引起一些這類片段與孔中探針的雜交。洗滌DNA芯片以僅保持孔中形成的雜交體后，每一孔熒光的測量隨后通過高分辨率掃描儀實施，該量度代表孔中存在的雜交體數量。隨后應用表述“探針熒光”或“探針強度”。

為較好理解以下內容，必須引入下列定義。因此，術語“探針”指構成DNA芯片、更常指采用與探針雜交的任何裝置的含氮堿基或“核苷酸”序列。術語“靶”指來自轉錄物的含氮堿基序列，能與其探針形成雜交體。表述“特異靶”涉及這樣的靶，其對應于已鑒定的轉錄物的一部分、根據堿基序列和轉錄物中的定位針對其設計探針。術語“完美”或“相同”雜交體涉及由探針和靶形成的雜交體，其在含氮堿基方面彼此嚴格互補(雜交體更多地被稱為“完美匹配”)。表述“錯配”涉及探針與靶的雜交體，其中彼此面對的探針的堿基與靶的堿基不互補(更多地被稱為“錯配”)或是不面對任何堿基的靶的或探針的堿基(更多地被稱為“缺口”)。這也稱為探針與靶錯配。術語“k-聚體”涉及k個核酸堿基的序列。含氮堿基序列的“長度”對應于其包含的含氮堿基數目。探針/靶雜交體的長度更通常對應于探針的長度。

DNA芯片的一般原理似乎簡單，因為其包括選擇對應于互補轉錄物片段的DNA序列的探針，然而難以將其付諸實施以獲得高質量DNA芯片。

事實上，首先，可能認為選擇與靶形成完美雜交體的探針是足夠簡單的。目前，完美雜交體可能太不穩定，從而無法耐受洗滌，這最終導致所測信號過弱，無法確定轉錄物表達水平。因此應注意，對于給定轉錄物，其產生探針的部分不等同，因而最好是選擇能獲得足夠穩定以獲得有意義的測量的探針/靶雜交體的轉錄物部分。此外，潛在顯示一個或多個錯配的探針與靶也可能穩定雜交。這種靶能夠與特異靶不同，可源自生物樣品中存在的另一轉錄物，該情況中獲得錯誤檢測或“假陽性”。

這是尋求探針的原因，所述探針：

-僅靶向轉錄物的單一確定部分，該部分獨特且因而與在另一位置的轉錄物自身或生物樣品內可能存在的另一轉錄物中所見不同，并展示出與顯示錯配的任何其它靶親和性低。隨后應用表述“特異探針”；和

-展示出與特異靶的強親和性，即與之形成穩定雜交體。這稱為“探針與特異靶的強親和性”，或者“親和”或“敏感”探針。