[發明專利]顯現單個細胞中的修飾的核苷酸和核酸相互作用

有效

• 申請號: 201580069922.0
• 申請日: 2015-12-22
• 公開（公告）號: CN107109399B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: V.帕爾漢;C.克里德
• 申請（專利權）人: 西格馬－奧爾德里奇有限責任公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12Q1/6841;G01N33/50
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 劉辛;羅文鋒

用于顯現單個細胞中的特異性核酸序列中的修飾的核苷酸或特異性核酸序列相互作用的方法，其中所述方法包括將原位雜交(ISH)反應與鄰近連接測定(PLA)反應偶聯。

領域

本公開涉及用于顯現單個細胞中的特異性核酸序列中的修飾的核苷酸或特異性核酸序列相互作用的方法。

背景

表觀遺傳學是指在DNA序列沒有改變的情況下發生的基因表達的遺傳變化。主要表觀遺傳過程包括DNA甲基化和組蛋白共價修飾。存在許多技術可用于在分子水平或基因組規模上研究表觀遺傳標記。然而，需要的是，顯現個體細胞中在單個基因組基因座的表觀遺傳標記的技術。

概述

在本公開的各個方面中，提供了用于顯現細胞中特異性核酸序列中的修飾的核苷酸的方法。所述方法包括：a)使制備的細胞與至少一種核酸探針接觸，所述至少一種核酸探針用至少一種標記物標記且與該特異性核酸序列互補，其中所述核酸探針與所述特異性核酸序列雜交以形成雜交細胞；b)使所述雜交細胞與第一結合劑和第二結合劑接觸，所述第一結合劑結合所述核酸探針的標記物，所述第二結合劑結合所述修飾的核苷酸；和c)通過鄰近連接測定法檢測所述第一和第二結合劑以顯現細胞中的特異性核酸序列中的修飾的核苷酸。在一些實施方案中，制備的細胞是固定的，透化的，并且任選地包含變性的染色體DNA。在其它實施方案中，所述修飾的核苷酸選自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、5-羥甲基胞苷、5-甲酰基胞苷、5-羧基胞苷、1-甲基腺苷、6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、黃嘌呤核苷、肌苷、二氫尿苷或假尿苷或具有2'-O-甲基化的修飾的核糖。在進一步實施方案中，所述特異性核酸序列選自啟動子DNA、增強子DNA、CpG島、編碼DNA、內含子DNA、信使RNA、微小RNA、非編碼RNA、長非編碼RNA、核糖體RNA、轉移RNA、小核RNA、小核仁RNA、SmYRNA、YRNA、剪接的前導RNA、端粒酶RNA組分、小干擾RNA、Piwi-相互作用RNA或反式作用RNA。在其它實施方案中，所述標記物是選自生物素、洋地黃毒苷、二硝基苯基、熒光素、二乙基氨基香豆素、羅丹明、花青3、花青5或德克薩斯紅的半抗原或染料。在仍然其它實施方案中，所述核酸探針是線性或環狀的，包含DNA、RNA、LNA或其組合，并且具有約15個核苷酸至約500個核苷酸的長度。在替代實施方案中，所述細胞是選自真核細胞、哺乳動物細胞、人細胞、正常細胞或癌細胞的個體細胞，或者所述細胞在獲得自真核生物的組織樣品或流體樣品內。在一些實施方案中，其中所述修飾的核苷酸是5-甲基胞苷，并且所述特異性核酸序列是Septin 9啟動子。