[發明專利]使用由兩個載體表達的拆分的Cas9的基因組編輯

有效

• 申請號: 201580069646.8
• 申請日: 2015-11-19
• 公開（公告）號: CN107109422B
• 公開（公告）日: 2021-08-13
• 發明（設計）人: 金晉秀;具兌英
• 申請（專利權）人: 基礎科學研究院
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N5/10;C12N9/22
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 陳桉

本發明涉及一種用于調節基因表達的方法，該方法包括將表達包含Cas9蛋白質的N末端的第一結構域的重組載體和表達包含Cas9蛋白質的C末端的第二結構域的重組載體中的每個都導入到細胞中，本發明還涉及一種包含所述重組載體的組合物，一種用于調節基因表達的試劑盒，以及一種用于在細胞內制備Cas9蛋白質的方法。此外，本發明涉及一種導入了包裝第一結構域的病毒載體和包裝第二結構域的病毒載體的轉化細胞，并且涉及一種包含由該轉化細胞制備的病毒的組合物。

技術領域

本發明涉及一種用于調節基因表達的方法，該方法包括將表達包含Cas9蛋白質的N末端的第一結構域的重組載體和表達包含Cas9蛋白質的C末端的第二結構域的重組載體中的每個都導入到細胞中；本發明涉及包含重組載體的組合物；用于調節基因表達的試劑盒和用于細胞內制備Cas9蛋白質的方法。

此外，本發明涉及被導入了包裝第一結構域的病毒載體和包裝第二結構域的病毒載體的轉化細胞并涉及包含由其制備的病毒的組合物。

背景技術

限制酶作為當前廣泛用于基因工程的工具，是當前分子生物學研究中最重要工具之一。然而，由于出現了對于可用于處理基因組大小的DNA且用作能夠識別和切割長度為9bp或以上的DNA核苷酸序列的″稀有切割器″的限制酶的需要，所以已經進行了各種嘗試。

作為此類嘗試的一部分，開發了人工核酸酶，諸如大范圍核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)和TAL效應子核酸酶(TALEN)，該人工核酸酶是能夠誘導細胞和微生物中的內源基因突變、靶基因插入和染色體重排的工具。這些人造核酸酶可以有效地用作各種領域(包括基因工程領域、生物技術領域和醫療領域)中的強力和通用工具。作為使用被稱為微生物免疫系統的CRISPR/Cas系統的第三代可編程核酸酶的RGEN(RNA引導的工程化核酸酶)的最新發展已經引起在生物技術領域中的所有方面上的新發現和創新(Kim，H等人，《自然評論：遺傳學》，2014年第15卷，第321頁至334頁)。

如上所述的人造核酸酶識別細胞中的特異性靶核苷酸序列以誘導DNA雙鏈斷裂(DSB)。誘導的細胞內DSB可以通過細胞的內源性DNA修復機制(同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ))修復，其中發生靶特異性突變和基因修飾。當同源DNA供體不存在于真核細胞和生物體中時，由核酸酶誘導的DSB可以主要由NHEJ機制而非HR機制修復。HR介導的突變發生在HR供體DNA中的序列正確拷貝時，但NHEJ介導的突變隨機發生。因為NHEJ是易錯的修復機制，所以在發生DSB的區域中可發生少量插入/刪除突變(插入缺失突變)。此類突變誘導移碼突變，從而導致基因突變。

具體地，CRISPR/Cas系統的Cas9蛋白質是設計真核細胞和生物體中基因修飾的有用工具。然而，編碼Cas9蛋白質的基因的大小很大，并且為此，當將Cas9蛋白質插入用于細胞內遞送的病毒載體中時，存在這樣的問題：由于病毒載體的有限包裝能力，病毒制備效率低并且細胞內遞送的效率低。因此，需要聚焦在通過病毒載體表達Cas9蛋白質的研究。

發明內容

技術問題

本發明人已經進行了廣泛努力來克服病毒載體的有限包裝能力并且開發出能夠通過病毒載體表達Cas9蛋白質的系統。因此，本發明人已經將Cas9蛋白質分割成兩個可包裝到病毒載體中的結構域，并且已經構建能夠表達結構域中的每個的重組載體。此外，本發明人已經發現，當重組載體導入到細胞中時，結構域彼此融合以表現出對基因組靶DNA的插入缺失(插入或刪除)效應，從而完成本發明。

技術方案

本發明的目的在于提供用于調節基因表達的方法，該方法包括將表達包含Cas9蛋白質的N末端的第一結構域的重組載體和表達包含Cas9蛋白質的C末端的第二結構域的重組載體中的每個都導入到細胞中。

本發明的另一個目的在于提供組合物，該組合物包含表達包含Cas9蛋白質的N末端的第一結構域的重組載體和表達包含Cas9蛋白質的C末端的第二結構域的重組載體。