[發明專利]單核苷酸多態性檢測用寡核苷酸探針及單核苷酸多態性檢測方法

有效

• 申請號: 201580068923.3
• 申請日: 2015-12-02
• 公開（公告）號: CN107109398B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 道行悟
• 申請（專利權）人: 榮研化學株式會社
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12N15/11
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 王靈菇;白麗

本發明涉及一種針對存在單核苷酸多態性的靶核酸使用的單核苷酸多態性檢測用寡核苷酸探針，其包含報告區域、錨固區域和接頭區域。報告區域具有由在單核苷酸多態性的核苷酸為第一核苷酸時完全匹配、在為除第一核苷酸以外時不匹配的堿基序列構成的寡核苷酸、和報告區域與靶核酸雜交時發生消光的熒光色素。

技術領域

本發明涉及單核苷酸多態性檢測用寡核苷酸探針及單核苷酸多態性檢測方法。

背景技術

在哺乳類等多細胞生物或者細菌、病毒等生物的基因水平中，以一定頻率可見的核酸在堿基序列上的一些差異被稱為基因變異。核酸在堿基序列上的差異是因替換、插入、缺失或者重組而發生的。其在堿基序列上的差異中，特別地將某些群體內以1％以上的頻率存在的變異稱為基因多態性。

基因多態性中，特別地將因堿基序列上的單堿基替換引起的多態性稱為單核苷酸多態性(以下有時也省略地記為“SNP：Single Nucleotide Polymorphism”)。SNP因在人基因組中可見的變異中出現頻率最高而受到關注。即，這是因為期待有可能通過收集與基因多態性的位置和變動有關的信息，將個體基因與具有通常表現型的野生型基因進行比較，對多態性的有無與表現型之間的關聯性進行分析，從而獲得大量信息。

另外，由于基因多態性以一定的頻率在群體中廣泛存在，因此并不是完全不伴隨性狀變化的基因多態性、或者特別是對生存(生殖)不利的性狀、換言之控制可稱為遺傳特征的性狀的基因多態性受到關注。例如，已知罹患糖尿病、高血壓、肥胖等生活習慣病、風濕病、過敏癥等免疫疾病、或者癌癥等疾病的難易性由多態性控制。此外認為，藥劑代謝(藥物發揮藥效的方式)及人白細胞組織適合型抗原等也由多態性支配。另外，認為不限于人、細菌的幾種耐藥性也由特定的基因中的SNP決定。因此期待SNP分析對于根據個體基因的類型給予最適藥劑的定制醫療、及近年成為問題的多藥耐性病原菌的鑒定是有用的。

到目前為止開發了各種SNP的檢測方法及檢測探針。作為檢測方法，可列舉出例如熒光標記探針法。該方法為根據熒光標記探針與作為靶的核酸在完全匹配或不匹配時的雜交效率之差，判斷作為靶的核酸的堿基序列中是否存在SNP的方法。因此，探針越短、SNP的檢測靈敏度越上升，但過短時，與作為靶的堿基序列的結合力降低、存在變得無法雜交的問題。為了解決這樣的問題，到目前為止開發了包含用于檢測SNP的區域、用于識別SNP附近的堿基序列的區域、和用于將這兩個區域連接的區域的熒光標記探針(專利文獻1及2)。

專利文獻1公開了一種寡核苷酸，其包含：(a)與靶核酸的核酸殘基的第一序列互補的核酸區域及(b)包含至少1個交聯區及至少1個結合區的可變區，其中，在該區域(a)與該靶核酸的核酸殘基的該第一序列形成穩定的雙鏈的條件下，該可變區可區分出：(i)與該結合區互補的該靶核酸的核酸殘基的第二序列和(ii)包含與該結合區不互補的至少1個核酸殘基的該靶核酸的核酸殘基的第二序列。另外，專利文獻1中記載了，交聯區包含通用堿基或者非氫鍵的天然堿基或它們的類似物、或者通用堿基及非氫鍵的天然堿基或它們的類似物的混合物。

專利文獻2中公開了一種探針，其是進行了可檢測標記的探針，當該探針包含錨固核酸區及報告基因核酸區，并且錨固與報告區通過非核苷接頭連接，在靶核酸不存在時錨固及報告區均不形成莖環，并且(i)所述探針不會在聚合酶作用下延伸、(ii)所述接頭在錨固區的3’末端的2個核苷酸內與錨固區結合、且在報告區的5’末端的2個核苷酸內與報告區結合、錨固區不與可檢測的標記結合。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特表2006-525027號公報

專利文獻2：日本特表2013-501508號公報

發明內容

發明所要解決的課題