[發明專利]一種用于鑒定樣品中的含有靶核苷酸序列的一個或多個核酸分子的方法

有效

• 申請號: 201580066531.3
• 申請日: 2015-10-08
• 公開（公告）號: CN107002145B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: F·巴拉尼;J·W·愛夫卡維茨;C·魯伊斯·盧埃達;J·黃;P·B·菲恩伯格
• 申請（專利權）人: 康奈爾大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 北京市萬慧達律師事務所 11111
• 代理人: 白華勝;王蕊

1.一種用于鑒定樣品中的含有靶核苷酸序列的一個或多個核酸分子的方法，所述靶核苷酸序列因一種或多種核苷酸、一個或多個拷貝數、一種或多種轉錄物序列和/或一個或多個甲基化殘基而不同于所述樣品或其他樣品中的其他核酸分子中的核苷酸序列，所述方法包括：

提供含有的一個或多個核酸分子的樣品，所述一個或多個核酸分子潛在含有因一種或多種核苷酸、一個或多個拷貝數、一種或多種轉錄物序列和/或一個或多個甲基化殘基而不同于其他核酸分子中的所述核苷酸序列的所述靶核苷酸序列；

提供能夠消化所述樣品中存在的含有脫氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的一種或多種酶；

提供一個或多個一級寡核苷酸引物組，每個一級寡核苷酸引物組包括(a)第一一級寡核苷酸引物，其包含與鄰近所述靶核苷酸序列的序列互補的核苷酸序列，和(b)第二一級寡核苷酸引物，其包含與由所述第一一級寡核苷酸引物形成的延伸產物的一部分互補的核苷酸序列；

將所述樣品、所述一個或多個一級寡核苷酸引物組、能夠消化所述樣品中的含有脫氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一種或多種酶、包含dUTP的脫氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成聚合酶鏈式反應混合物；

使所述聚合酶鏈式反應混合物經歷適于消化所述聚合酶鏈式反應混合物中存在的含有脫氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的條件，以及包括變性處理、雜交處理和延伸處理的一個或多個聚合酶鏈式反應循環，從而形成包含所述靶核苷酸序列或其互補序列的一級延伸產物；

將所述一級延伸產物與連接酶和一個或多個寡核苷酸探針組共混以形成連接反應混合物，其中每個寡核苷酸探針組包括(a)第一寡核苷酸探針，其具有5’引物特異性部分和3’靶核苷酸序列特異性部分，和(b)第二寡核苷酸探針，其具有5’靶核苷酸序列特異性部分和3’引物特異性部分，并且其中探針組的所述第一寡核苷酸探針和所述第二寡核苷酸探針被構造成以堿基特異性方式雜交于一級延伸產物的互補靶核苷酸序列上；

使所述連接反應混合物經歷一個或多個連接反應循環，由此將所述一個或多個寡核苷酸探針組的所述第一寡核苷酸探針和所述第二寡核苷酸探針連接在一起以在所述連接反應混合物中形成連接產物序列，其中每個連接產物序列包含所述5’引物特異性部分、所述靶特異性部分和所述3’引物特異性部分；

提供一個或多個二級寡核苷酸引物組，每個二級寡核苷酸引物組包括(a)第一二級寡核苷酸引物，其包含與所述連接產物序列的所述5’引物特異性部分相同的核苷酸序列和(b)第二二級寡核苷酸引物，其包含與所述連接產物序列的所述3’引物特異性部分互補的核苷酸序列；

將所述連接產物序列、所述一個或多個二級寡核苷酸引物組、能夠消化含有脫氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的所述一種或多種酶、包含dUTP的脫氧核苷酸混合物以及DNA聚合酶共混以形成第二聚合酶鏈式反應混合物；

使所述第二聚合酶鏈式反應混合物經歷適于消化所述第二聚合酶鏈式反應混合物中存在的含有脫氧尿嘧啶(dU)的核酸分子的條件，以及包括變性處理、雜交處理和延伸處理的一個或多個聚合酶鏈式反應循環，從而形成二級延伸產物；以及

對所述樣品中的所述二級延伸產物進行檢測和區分以鑒定含有靶核苷酸序列的一個或多個核酸分子的存在，所述靶核苷酸序列因一種或多種核苷酸、一個或多個拷貝數、一種或多種轉錄物序列和/或一個或多個甲基化殘基而不同于所述樣品中的其他核酸分子中的核苷酸序列。