[發明專利]基因序列校驗組合物、方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201580065664.9
• 申請日: 2015-09-28
• 公開（公告）號: CN107278234A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: E.施雷伯;K.瓦馬;M.安德森
• 申請（專利權）人: 生命科技公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 劉辛,黃希貴

1.一種用于對至少一個擴增子進行測序的方法，其包含以下步驟：

a)提供至少一個擴增子，其中所述至少一個擴增子包含相關序列和相對于從第一激活序列并入的相關序列位于5′的前導序列；

b)在包含多個核酸酶敏感性擴增引物的第一反應混合物中使所述至少一個擴增子擴增以形成經擴增的DNA產物；

c)使所述含有所述經擴增的DNA產物的第一反應混合物與包含核酸酶和至少一個化學增強型引物的第二反應混合物接觸，從而使所述多個核酸酶敏感性擴增引物由所述核酸酶降解；

d)使所述核酸酶失活；

e)在測序反應中用至少一個化學增強型引物激活所述經擴增的DNA產物；以及

f)制備所述至少一個化學增強型引物的延伸產物。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述延伸產物經熒光標記。

3.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中使用所述第一激活序列產生所述擴增子。

4.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述第一激活序列包含至少一個可裂解部分。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述前導序列是所述第一激活序列的一部分。

6.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述使所述第一反應混合物與所述第二反應混合物接觸、使所述核酸酶失活以及制備所述化學增強型引物的延伸產物的步驟是在同一個反應容器中進行。

7.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述使所述至少一個擴增子擴增、使所述第一反應混合物與所述第二反應混合物接觸、使所述核酸酶失活以及制備所述化學增強型引物的延伸產物的步驟是在不存在中間純化步驟的情況下進行。

8.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述至少一個擴增子進一步包含相對于所述相關序列位于3′的接續序列，其中所述接續序列與用于產生所述至少一個擴增子的第二激活序列互補。

9.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述至少一個擴增子具有約100個核苷酸到約400個核苷酸的長度。

10.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述相關序列具有約100個核苷酸到約300個核苷酸的長度。

11.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述至少一個擴增子是多個擴增子。

12.根據權利要求11所述的方法，其中所述多個擴增子包含至少兩個不同擴增子，第一個具有包含主要變異序列的相關序列并且第二個包含來自樣品核酸的相同區域的次要變異序列。

13.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其進一步包含：

a)基于所述測序反應獲得測序結果；以及

b)基于所述結果測定至少所述相關序列的核苷酸堿基序列。

14.根據權利要求13所述的方法，其中所述測序結果是通過基于遷移率的分離方法獲得。

15.根據權利要求14所述的方法，其中所述基于遷移率的分離方法是毛細電泳。

16.根據權利要求13所述的方法，其中比較所測定的至少所述相關序列的核苷酸堿基序列與從NGS測序方法獲得的至少所述相關序列的第二核苷酸堿基序列。

17.根據權利要求16所述的方法，其中所述NGS測序方法是半導體測序。

18.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述第二反應混合物進一步包含聚合酶、脫氧核苷酸三磷酸酯和經染料標記的雙脫氧核苷酸三磷酸酯。

19.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中擴增DNA包含聚合酶鏈反應擴增。

20.根據前述權利要求中任一權利要求所述的方法，其中所述第一反應混合物進一步包含聚合酶。

21.根據權利要求20所述的方法，其中所述聚合酶是熱穩定聚合酶。

22.根據權利要求20到21中任一權利要求所述的方法，其中所述聚合酶是Taq聚合酶。