[發明專利]用于測定神經毒素多肽的生物活性的方法

有效

• 申請號: 201580062143.8
• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN107003310B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 卡爾-海因茨·艾澤勒
• 申請（專利權）人: 莫茨藥物股份兩合公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;C07K19/00
• 代理公司: 北京柏杉松知識產權代理事務所(普通合伙) 11413
• 代理人: 王慶艷;劉繼富

1.一種用于測定神經毒素的生物活性的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)在神經毒素敏感細胞中表達融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)錨定蛋白，(ii)報告蛋白和(iii)插入所述錨定蛋白與所述報告蛋白之間的神經毒素切割位點；

其中，所述錨定蛋白是穩定地附著于或整合到質膜中并與神經毒素敏感細胞的細胞溶質接觸的多肽，并且所述錨定蛋白選自膜蛋白、跨膜蛋白或整合膜蛋白、或膜相關蛋白；

(b)將(a)的神經毒素敏感細胞與神經毒素一起溫育并在允許所述神經毒素發揮其生物活性的條件下培養所述神經毒素敏感細胞；

(c)將(b)的神經毒素敏感細胞在允許從透化的神經毒素敏感細胞釋放所述報告蛋白但不釋放所述錨定蛋白的條件下透化；和

(d)量化從(c)的透化的神經毒素敏感細胞釋放的所述報告蛋白的活性，

從而確定所述神經毒素的生物活性。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述神經毒素敏感細胞源自腫瘤細胞系、原代細胞、干細胞或誘導多能干細胞。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述錨定蛋白是選自膽堿轉運蛋白、H1受體、G蛋白偶聯受體(GPCR)和SV2的膜蛋白。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述神經毒素切割位點選自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和TeNT切割位點。

5.根據權利要求1所述的方法，其中所述報告蛋白是選自熒光素酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根過氧化物酶(HRP)的酶或選自GFP、YFP、BFP和RFP的熒光蛋白。

6.根據權利要求1所述的方法，其中溶血素用于所述神經毒素敏感細胞的透化。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述溶血素選自鏈球菌溶血素O、產氣莢膜梭菌溶血素O、肺炎球菌溶血素、細菌溶血素和來自蛇或蜘蛛的成孔毒素。

8.根據權利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白包括選自膽堿轉運蛋白-GFP-SNAP-25-熒光素酶、H1受體-SNAP-25-熒光素酶和H1受體-SNAP-25-HRP的融合蛋白。

9.根據權利要求1所述的方法，其中所述報告蛋白的活性的定量包括所述報告蛋白的活性的標準化。

10.根據權利要求9所述的方法，其中所述報告蛋白的活性的標準化是通過測定留在所述神經毒素敏感細胞中或所述神經毒素敏感細胞處的非切割融合蛋白的殘余報告蛋白活性或者所述融合蛋白的總報告蛋白活性來進行的。

11.一種融合蛋白，其由(i)錨定蛋白、(ii)報告蛋白和(iii)插入所述錨定蛋白與所述報告蛋白之間的神經毒素切割位點組成，用于測定神經毒素在神經毒素敏感細胞中的生物活性；

其中，所述錨定蛋白是穩定地附著于或整合到質膜中并與神經毒素敏感細胞的細胞溶質接觸的多肽，并且所述錨定蛋白選自膜蛋白、跨膜蛋白或整合膜蛋白、或膜相關蛋白。

12.根據權利要求11所述的融合蛋白，其中所述錨定蛋白選自膽堿轉運蛋白、H1受體、G蛋白偶聯受體(GPCR)和SV2；所述報告蛋白是選自熒光素酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和辣根過氧化物酶的酶或選自GFP、YFP、BFP和RFP的熒光蛋白；并且所述神經毒素切割位點選自BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和TeNT切割位點。

13.根據權利要求11或12所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包括選自膽堿轉運蛋白-GFP-SNAP-25-熒光素酶、H1受體-SNAP-25-熒光素酶和H1受體-SNAP-25-HRP的融合蛋白。