[發明專利]復合式多步核酸擴增

在審

• 申請號: 201580061362.4
• 申請日: 2015-09-17
• 公開（公告）號: CN107002066A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發明（設計）人: P·帕特爾;I·吳;A·理查德森;K·貝爾霍欽;J·李;S·塔巴克曼
• 申請（專利權）人: 賽拉諾斯股份有限公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12M1/00;C12Q1/68
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 陶家蓉,余穎

1.一種用于擴增樣品中的靶核酸序列的方法，其包括：

首先通過第一核酸擴增法來擴增所述樣品中的一種或多種靶核酸序列的拷貝數；以及

其次通過第二核酸擴增法來進一步擴增所述樣品或其等分試樣中的所述一種或多種靶核酸序列的拷貝數。

2.如權利要求1所述的方法，其中所述第一核酸擴增法包括熱循環核酸擴增法。

3.如權利要求1所述的方法，其中所述第二核酸擴增法包括等溫核酸擴增法。

4.如權利要求1所述的方法，其中所述第一核酸擴增法包括熱循環核酸擴增法，并且所述第二核酸擴增法包括等溫核酸擴增法。

5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述第一核酸擴增法包括聚合酶鏈反應(PCR)核酸擴增法。

6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述第二核酸擴增法包括等溫核酸擴增。

7.如權利要求5所述的方法，其中通過所述PCR擴增法擴增的核酸包含DNA。

8.如權利要求5所述的方法，其中通過所述PCR擴增法擴增的核酸包含RNA。

9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述擴增方法中使用的引物針對單個靶核酸序列及其互補序列。

10.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述擴增方法中使用的引物針對多個靶核酸序列及其互補序列。

11.一種用于檢測共同核酸分子上的第一遺傳元件和第二遺傳元件的方法，該方法包括：

利用第一引物和第二引物進行第一核酸擴增反應，其中所述第一引物和所述第二引物都在引物的5’端上被磷酸化，其中所述第一引物與所述第一遺傳元件互補，其中所述第二引物與所述第二遺傳元件互補，并且其中形成了第一反應產物，其中所述第一反應產物含有所述第一遺傳元件的至少一部分和所述第二遺傳元件的至少一部分，其中所述第一遺傳元件的至少一部分和所述第二遺傳元件的至少一部分在所述第一反應產物中彼此相隔X個核苷酸；

將所述第一反應產物與連接酶一起溫育，以至少形成含有所述第一反應產物的第一連接產物，其中在所述第一連接產物內，所述第一遺傳元件的至少一部分的拷貝和所述第二遺傳元件的至少一部分的拷貝彼此相隔少于X個核苷酸；

利用第三引物和第四引物進行第二核酸擴增反應，其中所述第三引物與所述第一遺傳元件互補，并且其中所述第四引物與所述第二遺傳元件互補，其中形成了第二反應產物；以及

檢測所述第二反應產物。

12.一種用于擴增多核苷酸模板的方法，該方法包括：

A)在聚合酶鏈反應(PCR)擴增反應混合物中生成多個拷貝的多核苷酸模板，其中所述PCR擴增反應混合物包含第一PCR擴增反應引物和第二PCR擴增反應引物，其中在所述PCR擴增反應混合物中，所述第一PCR擴增反應引物與所述多核苷酸模板退火并且所述第二PCR擴增反應引物與互補于所述多核苷酸模板的多核苷酸退火，并且其中在所述PCR擴增反應混合物中，形成了多個拷貝的PCR擴增反應產物，其中所述PCR擴增反應產物為包含第一鏈和第二鏈的雙鏈核酸分子，并且其中所述PCR擴增反應產物的第一鏈為所述多核苷酸模板的拷貝；

B)在包含非熱循環反應第一引物和非熱循環反應第二引物的非熱循環反應混合物中溫育所述多核苷酸模板的拷貝，其中：

所述多核苷酸模板包含第一部分、第二部分和第三部分，其中所述第三部分在所述多核苷酸模板中位于所述第一部分與所述第二部分之間；

所述第一引物包含第一區和第二區，其中所述第一引物的所述第二區與所述多核苷酸模板的所述第一部分互補；并且

所述第二引物包含第一區和第二區，其中所述第二引物的所述第二區與所述PCR擴增反應產物第二鏈中互補于所述多核苷酸模板的所述第二部分的序列互補，所述第二引物的所述第一區與所述第一引物的所述第一區互補，并且所述第二引物的所述第一區與所述多核苷酸模板的所述第三部分互補。

13.如權利要求12所述的方法，其中所述多核苷酸模板的所述第一部分和第二部分的長度均在6至30個核苷酸之間。

14.如權利要求12或13所述的方法，其中所述多核苷酸模板的所述第三部分的長度在4至14個核苷酸之間。