[發明專利]可溶內含肽融合蛋白以及用于純化生物分子的方法

有效

• 申請號: 201580059731.6
• 申請日: 2015-10-23
• 公開（公告）號: CN107406514B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: M·齊爾曼;J·奧蘭多
• 申請（專利權）人: 默克專利有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/50;C12N9/00;B01D15/38;C07K1/22
• 代理公司: 北京高文律師事務所 11359
• 代理人: 徐江華

本發明涉及包括N?內含肽多肽和N?內含肽溶解配偶體的融合蛋白，和包括此類融合蛋白的親和色譜基質，及其使用方法。

相關申請

本申請要求于2014年11月3日提交的美國臨時申請號62/074,494，以及于2015年8月24日提交的美國臨時申請號62/209,010的權益。上述申請的全部教示內容通過引用結合在此。

發明領域

本發明涉及包括N-內含肽多肽和N-內含肽溶解配偶體的融合蛋白，包括此類融合蛋白的親和色譜基質，和在蛋白質純化和肽連接過程中，特別是在工業規模下使用此類融合蛋白的方法。

發明背景

涉及用親和標記物來標記感興趣的蛋白質的蛋白質純化方法廣泛用于針對RD應用的實驗室條件，但已經證明對于大規模生產操作是不切實際的。在生物加工工業中，僅使用可裂解的親和標記物來確保終產物不包含標記物，該標記物必須在生產過程中通常使用位點特異性蛋白酶來除去。去除該親和標記物需要另外的加工步驟，其很大程度地增加了成本和時間，特別在工業規模下。此外，低效和位點外裂解導致最終蛋白質產物被分別保留標記物和截短的蛋白質片段的蛋白質污染，這在生物加工應用中是不可接受的。

因此，需要開發允許在工業條件下大規模純化蛋白質的改進的親和色譜試劑和方法。

發明概述

內含肽是包含蛋白酶和連接酶活性的一類自動催化的酶。稱為“斷裂內含肽”的一類內含肽涉及，包括兩種互補的半內含肽，稱為N-內含肽和C-內含肽，其選擇性地并且非常緊密地締合以形成活性的內含肽酶(沙阿N.H.(Shah N.H.)等人，美國化學會會志(J.Amer.Chem.Soc.)135:18673-18681；達薩B.(Dassa B.)等人，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)，37:2560-2573(2009))。

先前在現有技術中已經描述了內含肽(包括斷裂內含肽)在大規模的蛋白質純化過程中的用途(參見，例如，WO 2013/045632)。先前還描述了斷裂內含肽用于從粗混合物中色譜分離感興趣的蛋白質的用途(參見，例如，中國公開號CN 101884910；關D.(Guan D.)，等人，生物技術與生物工程(Biotech.Bioeng.)110:2471-2481(2013)；劉W.(Lu W.)，等人，染色體雜志(J.Chrom.A)，1218:2553-2560(2011))。

然而，當在常見的表達系統(如大腸桿菌)中表達時，內含肽在大規模蛋白質純化過程中的使用受其差溶解度阻礙。此外，尚未描述包括共價附接至固體支持物的基于內含肽的親和配體的色譜基質，其對于有效的工業規模的蛋白質純化過程是關鍵的。

本發明提供了包括能夠通過與包括C-內含肽多肽的第二融合蛋白相締合來形成有活性的內含肽復合體的N-內含肽多肽的可溶融合蛋白。可以將包括N-內含肽多肽的融合蛋白共價附接至固體支持物，以產生適合用于大規模生物加工應用的親和色譜基質。

因此，在一個實施例中，本發明涉及包括由肽鍵連接的N-內含肽多肽和N-內含肽溶解配偶體的融合蛋白。在本實施例的一個具體的方面，該N-內含肽溶解配偶體具有小于約15kDa的分子量、小于約60的脂肪族氨基酸指數值、和小于-1的總平均親水性值，并且增強(例如，增加和/或促進)了N-內含肽多肽的溶解度。在本實施例的另外方面，該N-內含肽溶解配偶體包括SEQ ID NO:15。在本實施例的又另一個方面中，該N-內含肽多肽是GP41-1N-內含肽(SEQ ID NO:1)，或其變體。

在另一個實施例中，本發明涉及包括融合蛋白的親和色譜基質，該融合蛋白包括N-內含肽多肽和N-內含肽溶解配偶體，并且附接至固體支持物。在本實施例的一個具體的方面，該固體支持物是包括親水性聚乙烯醚基的色譜樹脂。