[發明專利]在細菌中產生雙鏈蛋白質的方法

有效

• 申請號: 201580059703.4
• 申請日: 2015-11-05
• 公開（公告）號: CN107075548B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: J·朱利安諾蒂;D·賴利;K·奧羅里;L·C·西蒙斯
• 申請（專利權）人: 基因泰克公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 張紅春

1.一種在原核宿主細胞中產生包含T細胞受體(TCR)α鏈和TCR β鏈的抗癌免疫動員單克隆T細胞受體(ImmTAC)的方法，所述方法包括：

(a) 在培養基中在如下條件下培養所述宿主細胞以表達所述ImmTAC的TCR α鏈和TCRβ鏈：

包括生長溫度和生長攪拌速率的生長期，

自所述生長溫度至更低產生溫度的溫度變動，自所述生長攪拌速率至更低產生攪拌速率的攪拌速率變動，和

包括所述產生溫度和所述產生攪拌速率的產生期，借此在表達后，所述TCR α鏈和所述TCR β鏈折疊并裝配以在所述宿主細胞中形成生物活性ImmTAC；

其中所述宿主細胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含

(1) 編碼所述ImmTAC的TCR α鏈的第一翻譯單元；

(2) 編碼所述ImmTAC的TCR β鏈的第二翻譯單元；

(3) 編碼肽基-脯氨酰基異構酶的第三翻譯單元，其中所述肽基-脯氨酰基異構酶是FkpA蛋白；和

(4) 編碼蛋白質二硫化物氧化還原酶的第四翻譯單元，其中所述蛋白質二硫化物氧化還原酶是DsbC蛋白；

其中在所述生長期期間所述生長溫度在30℃至34℃的范圍內，在所述產生期期間所述產生溫度在25℃至29℃的范圍內，所述生長攪拌速率足以實現在所述生長期期間所述宿主細胞的峰值氧攝取速率在3.5至4.5 mmol/L/min的范圍內，并且所述產生攪拌速率足以實現在所述產生期期間所述宿主細胞的氧攝取速率在1.0至3.0 mmol/L/min的范圍內；和

(b) 從所述宿主細胞回收所述生物活性ImmTAC，

其中所述原核宿主細胞是大腸桿菌。

2.如權利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸還包含啟動子的三個拷貝，其中第一拷貝與所述第一翻譯單元可操作組合，第二拷貝與所述第二翻譯單元可操作組合，并且第三拷貝與所述第三翻譯單元可操作組合以驅動所述TCR α鏈、所述TCR β鏈和所述FkpA蛋白的轉錄。

3.如權利要求2所述的方法，其中所述啟動子是誘導型啟動子。

4.如權利要求3所述的方法，其中所述誘導型啟動子是在不存在IPTG誘導下驅動所述TCR α鏈、所述TCR β鏈和所述FkpA蛋白的轉錄的IPTG誘導型啟動子。

5.如權利要求3所述的方法，其中所述誘導型啟動子是當所述培養基中的磷酸鹽已耗盡時驅動所述TCR α鏈、所述TCR β鏈和所述FkpA蛋白的轉錄的PhoA啟動子。

6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述多核苷酸還包含可選擇標記，并且所述培養基包含由單一抗生素組成的選擇劑以致使所述宿主細胞維持所述多核苷酸。

7.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述第一翻譯單元包含與所述TCR α鏈的編碼區可操作組合的第一翻譯起始區(TIR)，并且所述第二翻譯單元包含與所述TCR β鏈的編碼區可操作組合的第二翻譯起始區(TIR)，其中所述第一和第二TIR的相對翻譯強度是1.0至3.0。

8.如權利要求1所述的方法，其中所述FkpA是大腸桿菌FkpA。

9.如權利要求1所述的方法，其中所述DsbC蛋白是大腸桿菌DsbC。

10.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述大腸桿菌是具有degpS210A突變的菌株。