[發明專利]細胞培養基及使用其的培養方法

在審

• 申請號: 201580052840.5
• 申請日: 2015-08-19
• 公開（公告）號: CN108064265A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 加藤智久;金村米博;正札智子;福角勇人
• 申請（專利權）人: 株式會社鐘化;獨立行政法人國立病院機構
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12M1/00;C12M3/00;C12N5/07;C12N5/0735;C12N5/10
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 沈雪

本發明的課題在于提供一種不使用飼養細胞而能夠提高細胞的增殖效率的細胞培養基，特別是提供一種不含有血清的細胞培養基。根據本發明，可以提供一種含有纖維蛋白5及Zeta多肽的細胞培養基。

技術領域

本發明涉及使用了纖維蛋白5及Zeta多肽的細胞培養基、細胞用培養基試劑盒、細胞培養系統、細胞的培養方法、以及iPS細胞增殖劑。

背景技術

通過近年來的研究，人ES細胞(hESC)或人iPS細胞(hiPSC)等人多能干細胞在再生醫療領域中實用化的可能性正在增高。這些多能干細胞具有能夠無限增殖的能力和分化成神經細胞、心肌細胞、血液細胞或網膜細胞等各種細胞的能力，作為對疑難疾病、生活習慣病等的治療方法而備受期待。

飼養細胞起到將用于維持培養多能干細胞、特別是人多能干細胞的生長因子供給于干細胞的作用。因此，一直以來，hESC、hiPSC等人多能干細胞的培養主要在源自小鼠的飼養細胞(MEF：小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast))層上進行。然而，在源自小鼠的飼養細胞共存下進行培養的方法會在人多能干細胞中混入飼養細胞，因此在對生物體的安全性上存在問題。

因此，作為不使MEF等飼養細胞混入人多能干細胞而進行培養的方法，已知有將MEF化學固定于培養基材而培養多能干細胞的方法(非專利文獻1)。但是，上述培養方法仍存在未固定的細胞、剝離的細胞混入的可能性，并非完全防止飼養細胞的混入。而且，存在飼養細胞的品質不穩定的問題。

另一方面，作為能夠維持培養人多能干細胞的活性，報告了各種人細胞類型(非專利文獻2～5)。另外，還報告了不使用異種細胞而使用成纖維細胞、胎盤細胞、骨髓細胞、子宮內膜細胞等各種源自人的細胞作為飼養細胞的方法(非專利文獻6)。但是，在源自人的飼養細胞的共存下進行多能干細胞培養的方法存在培養時制備該飼養細胞費事的問題、飼養細胞的品質不穩定的問題。

作為在飼養細胞不共存下培養多能干細胞的技術，已知有使用預先將培養基用MEF條件化培養基(MEF-CM)進行培養的方法。例如，專利文獻1中記載了制備細胞條件化培養基(conditioned medium)的方法、及在MSC條件化培養基中存在14-3-3蛋白質zeta/delta(14-3-3protein zeta/delta)的情況，所述制備細胞條件化培養基的方法包括：在細胞培養用培養基中對間充質干細胞(MSC)、其后代或源自其的細胞系(cell line)進行培養的工序；以及對上述細胞培養基任選進行分離的工序，在所述細胞培養基中，以不一起培養的方式將胚胎干(ES)細胞集落或其后代接種于含有FGF的無血清培養基中，并使得到的細胞增殖，從而獲得上述間充質干細胞(MSC)。然而，在使用了這些條件化培養基的培養方法中，存在必須制備條件化培養基的繁瑣、飼養細胞的品質不穩定的問題，而且僅舉出了14-3-3蛋白質zeta/delta作為MSC條件化培養基中所含有的蛋白質的一個例子。

另一方面，不需要利用各種細胞進行條件化的培養基、即化學成分確定的培養基的開發也在進行。例如，報告了通過添加玻璃體結合蛋白與IGF1的嵌合蛋白質(chimericprotein)而能夠不使用飼養細胞培養ES細胞(非專利文獻7)。另外，作為含有具有促進增殖效果的IGF的培養基，已有STEM CELL Technologies公司的mTeSR1(注冊商標)、LifeTechnologies公司的STEMPRO(注冊商標)等在市場銷售。但是，對于多能干細胞的培養而言，仍存在無法穩定地培養、增殖性差這樣的課題。另外，雖然對MEF的分泌物中的功能性蛋白質進行了分析(非專利文獻8)，但尚未從條件化培養基中所含有的飼養細胞的分泌物中鑒定出有益的功能性蛋白質。