[發明專利]對TRACP-5b（酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b）具有特異性的蛋白定量法

有效

• 申請號: 201580051031.2
• 申請日: 2015-08-07
• 公開（公告）號: CN107002065B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 菊地涉;笹川久美子;野田健太
• 申請（專利權）人: 日東紡績株式會社
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C07K16/40;C12N5/10;C12N15/02;G01N33/53;G01N33/543;G01N33/545;G01N33/553;G01N33/577;C12N9/16;C12P21/08
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 鄭天松

本發明旨在提供對于特異性測定酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b有用的單克隆抗體。以從蠶絹絲腺純化的人重組酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b(TRACP?5b)作為抗原，由細胞融合，得到了產生有對TRACP?5b的反應性高于對酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5a(TRACP?5a)的反應性的特異性的針對TRACP?5b的單克隆抗體的雜交瘤。通過使用此單克隆抗體，可高靈敏度并且特異性檢測待測樣品中的TRACP?5b。

【技術領域】

本發明涉及產生對于酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b(TRACP-5b：別名、破骨細胞來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶)特異性的單克隆抗體、該單克隆抗體的雜交瘤、使用該單克隆抗體的TRACP-5b的檢測方法、以及在其中使用的試劑盒。

本發明的單克隆抗體作為骨吸收的標志物，在骨疾病的醫學治療或臨床檢查的領域中極有效。

【背景技術】

血清中的酒石酸抵抗性酸性磷酸酶(TRACP：Tartrate Resistant acidPhosphatase EC3.1.3.2)其大部分是破骨細胞來源的酸性磷酸酶，其測定作為評價破骨細胞的功能的指標有用，作為骨吸收標志物被感興趣(非專利文獻1)。一方面，血清中的酸性磷酸酶由聚丙烯酰胺凝膠電泳，從原點起分為0～5的6個條帶，在其中，第5是酒石酸抵抗性，從而被稱為Band5酒石酸抵抗性酸性磷酸酶(TRACP5)。這還由電泳分為與糖鏈的唾液酸鍵合多的5a和幾乎無唾液酸鍵合的5b。進而，5a是來自血小板或其他的酶而血中值不變動，與此相對，由于僅5b伴隨骨吸收而變動，5b被認為是破骨細胞來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶的本體(專利文獻1)。

再者，Clinical在Chemistry志(非專利文獻2)中也提議將破骨細胞來源的ACP簡寫為TRACP-5b。從而，在本說明書中也將破骨細胞來源、且表示成為骨吸收的指標的ACP表示為TRACP-5b，破骨細胞來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶和酒石酸抵抗性酸性磷酸酶 5b作為同義表示為TRACP-5b。

作為表示破骨細胞的活性的酸性磷酸酶的指標求出TRACP活性的以往的活性測定法在特異性、靈敏度、測定的復雜性及測定時間的方面有問題。

一般而言，由活性測定法的TRACP-5b的測定通過在酒石酸的存在下作為合成底物使用磷酸酯而對由酶反應發生的反應生成物(醇或苯酚類)進行比色定量求出酶活性。此時，酒石酸抑制前列腺來源酸性磷酸酶，通過將殘留的酸性磷酸酶活性用底物測定，將TRACP活性看作TRACP-5b活性而求出。但是，由于也測定了在待測樣品中存在的破骨細胞來源以外的紅細胞來源或血小板來源的酒石酸抵抗性酸性磷酸酶，在特異性的方面有問題。作為上述方法的改善法，將血清稀釋5倍的液于37℃溫育1小時的預處理之后，已知將其余的TRACP 活性在酒石酸存在下、作為底物使用p-硝基苯基磷酸(pNPP)而測定的方法(非專利文獻3及非專利文獻4)。此方法可回避紅細胞來源酸性磷酸酶的影響，但無法排除血小板來源酸性磷酸酶的影響。再者，作為更特異性的活性測定法，本發明人報告了利用TRACP-5b和紅細胞或血小板來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶活性對于氟的感受性有差異的TRACP-5b測定法(專利文獻2)。但是，盡管無紅細胞及血小板來源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶的影響，但無法排除TRACP-5a的影響，另外，通過從總酒石酸抵抗性酸性磷酸酶活性減去在氟存在下不被抑制的活性而求出TRACP-5b活性，在精度的方面要求進一步的改良。再者，報告有通過在上述利用氟的方法中組合TRACP-5a的抑制物質而使用，更特異性地測定TRACP-5b活性的方法(專利文獻3)。但是，盡管比僅使用氟的方法更有特異性，但由于仍然由減法求出破骨細胞來源TRACP-5b活性，同樣地在精度的方面留有問題。