[發(fā)明專利]用于在核酸測定中改善解鏈分辨和多重性的探針

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580050926.4
• 申請日: 2015-08-11
• 公開（公告）號: CN106715720B
• 公開（公告）日: 2021-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 斯科特·C·約翰遜;尼古拉斯·阿拉貝;道格·惠特曼
• 申請（專利權(quán)）人: 盧米耐克斯公司
• 主分類號: C12Q1/6818
• 分類號: C12Q1/6818;C12Q1/6823;C12Q1/6816
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 鄭斌;彭鯤鵬

1.用于檢測靶核酸存在的方法，其包括：

（a）使樣品與第一可切割探針接觸，所述探針從5’至3’包含（i）包含用報告基團-淬滅基團對的第一成員標記的至少一個非天然核苷酸的第一序列區(qū)；（ii）第二序列區(qū)；（iii）為所述第二序列區(qū)的反向互補的序列；和（iv）包含與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)互補的一個或更多個核糖核苷酸堿基的序列；

（b）使所述可切割探針與內(nèi)切核糖核酸酶接觸，從而切割與靶核酸雜交的探針以形成截短的可切割探針；

（c）使所述截短的可切割探針與其自身雜交以形成發(fā)夾探針；

（d）在能夠與所述第一序列區(qū)的所述至少一個非天然核苷酸堿基配對的用報告基團-淬滅基團對的第二成員標記的非天然核苷酸的存在下延伸所述發(fā)夾探針；以及

（e）通過檢測所述可切割探針和所述發(fā)夾探針上標記物的信號改變來檢測所述靶核酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中為所述第二序列區(qū)（ii）之反向互補的序列的一部分與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)互補。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述內(nèi)切核糖核酸酶是RNA酶H。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述RNA酶H是RNA酶HII。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述內(nèi)切核糖核酸酶是熱穩(wěn)定的RNA酶HII。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述內(nèi)切核糖核酸酶是嗜熱的、熱啟動的RNA酶HII。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可切割探針還包含（v）在所述第二序列區(qū)和為所述第二序列區(qū)的反向互補的序列之間的一個或更多個核苷酸的環(huán)序列。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述環(huán)序列的長度為4-20個核苷酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述環(huán)序列的長度為6-15個核苷酸。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述環(huán)序列的長度為10-15個核苷酸。

11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述環(huán)序列包含至少3個連續(xù)的A核苷酸。

12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述環(huán)序列包含3-5個連續(xù)的A核苷酸。

13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可切割探針包含位于核糖核苷酸堿基3’的延伸阻斷修飾。

14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述可切割探針包含在所述環(huán)序列中的延伸阻斷修飾。

15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二序列區(qū)的長度為6-20個核苷酸。

16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一序列區(qū)的長度為4-20個核苷酸。

17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)互補的序列的長度為10-50個核苷酸。

18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可切割探針的所述一個或更多個核糖核苷酸堿基正好位于為所述第二序列區(qū)之反向互補的序列末端的3’處。

19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可切割探針的所述一個或更多個核糖核苷酸堿基位于距離與所述靶核酸第一鏈上的第一區(qū)互補之序列的3’端至少4個堿基。