[發明專利]增加芽孢桿菌屬的植物促生菌的生物質和芽孢產生的方法

在審

• 申請號: 201580049072.8
• 申請日: 2015-08-13
• 公開（公告）號: CN107002025A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發明（設計）人: 瓦勒斯卡·維萊加斯·埃斯科巴爾;桑德拉·莫斯克拉·洛佩茲;路易莎·費爾南達·波薩達·烏里韋;埃杜格雷西亞·瑪麗亞·拉米雷斯·科雷亞;塔蒂阿娜·扎茲尼·奎利亞爾·加維里亞;約翰·杰羅·米勒·卡斯蒂略;盧斯·伊迪絲·阿赫利婭·羅爾丹
• 申請（專利權）人: 麥德林行政;金融和技術大學;哥倫比亞奧古拉巴納尼羅斯協會
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N3/00;A01N63/00;A01P21/00;A01P3/00;A01P1/00;C05F11/08;C05F9/04;C05F17/00;C12R1/125;C12R1/11;C12R1/07
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司31220
• 代理人: 鄭立,范潔瓊

技術領域

本發明涉及一種增加芽孢桿菌(Bacillus)屬的植物促生菌的生物質和芽孢產生的方法。該方法包括在適宜的培養基中培養微生物和在特定的物理化學的條件下培養，以顯著增加生物質的產生，使用更少的時間，芽孢形成率高。

背景技術

氮肥的使用引起的環境損害，以及控制機構對環境安全措施的要求，鼓勵了減少農業活動對環境的影響的可持續管理策略的研究。解決這個問題的一種選擇是使用植物促生微生物，其已經被證明在多種植物系統中是有效的(1-6)。

植物根際促生細菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，包括芽孢桿菌屬的，移生于植物的根際，有促進植物生長的能力，可通過直接機制，例如土壤養分溶解和產生植物激素，或者通過間接機制，例如酶產生，營養競爭和產生系統性抵抗力。這些微生物可以在培養基中快速地產生，鑒于它們產生芽孢，可以長時間地儲存(7-10)。

芽孢桿菌一些種的多種菌株(例如，枯草芽孢桿菌(B.Subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefacines)、蠟樣芽胞桿菌(B.cerues)、蕈狀芽胞桿菌(B.mycoides),炭疽芽孢桿菌(B.anthracis),蘇云金芽孢桿菌(B.thurigiensis))已經被認定為植物促生劑，在農業活動中是有用的(11-16)。但是，對于PGPR的定義是在菌株水平上做出的，不是在種的水平上。已經有一些出版物描述了產生芽孢桿菌屬的不同促生菌株的方法。

WO2009031874、WO2004024865和WO20050118011公開了多種芽孢桿菌菌株在促進植物生長中的用途。US20030228679描述了通過接種枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌菌種的植物促生細菌來提高植物生長的組分和方法。CN101381692描述了一種產生PGRP的培養基，由復合營養源如糖蜜糖漿和發酵的玉米汁制成。

盡管產生芽孢桿菌屬的一些方法已經被報道，但是因為獲得的生物質量少或者芽孢形成率低，其一般不超過50％，造成了一些問題。類似地，包括改進培養基以提高芽孢桿菌芽孢的產生的多種生產方法已經被公布，但是在芽孢形成率方面的結果仍然很差(17-23)。

發明內容

本發明涉及一種允許增加來自枯草芽孢屬的微生物的生物質和芽孢產生和高芽孢形成率(85％以上)的方法，使用合適的培養基(SBM培養基)和通風、攪拌、pH和溫度的特定的物理化學條件。本發明的方法減少了在生產過程中的操作，并增加了生物質產生和芽孢形成率，使該微生物的大規模生產更加適當且經濟適用。

附圖說明

圖1是接種不同微生物濃度的枯草芽孢桿菌EA-CB0575的芽孢和營養細胞及不同接種時間的香蕉植株的總干重。

具體實施方式

本發明的方法包括，作為初始步驟，通過在一種富集固體培養基(TSA)中培養活化芽孢桿菌屬的微生物，在合適的培養基中接種預接種物，用特定的物理化學條件培養以獲得生物質和/或芽孢。

在本發明的一個優選的實施方式中，芽孢桿菌屬的微生物選自由解淀粉芽孢桿菌EA-CB0158、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)EA-CB0177、解淀粉芽孢桿菌EA-CB0123、枯草芽孢桿菌EA-CB0575、高地芽孢桿菌(Bacillus altitudinis)EA-CB0686、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)EA-CB0784、短小芽孢桿菌1077和枯草芽孢桿菌EA-CB1121組成的組。

根據本發明適合產生PGPR微生物的培養基(以下為SBM培養基)包括一個或多個碳源、一個或多個氮源、鹽、常量營養元素、微量營養元素、pH緩沖液和消泡劑。為了準備SBM培養基，碳源、氮源和常量營養元素在蒸餾水中混合，對得到的混合物滅菌；當滅菌后，加入預先滅菌的含有濃度在0.1至1.0摩爾濃度的鹽的水溶液(儲備)。

在本發明的一個優選的實施方式中，SMB培養基包括一個或多個選自由葡萄糖、酵母提取物或肉膏、MgSO₄、MnCl₂、KH₂PO₄、蛋白胨、CaCl₂、ZnSO₄、NaCl和FeSO₄組成的組的成分在一種固體、半固體或液體基質中。