[發(fā)明專利]以重組血清型9禽腺病毒載體形式的疫苗

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580042608.3
• 申請日: 2015-08-06
• 公開（公告）號: CN106661592A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: B·洛扎諾-杜伯納德;E·索托-普里安特;D·薩法蒂-米茲拉西
• 申請（專利權(quán)）人: 皮卡里奧工業(yè)集團股份公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K39/12;A61K39/145;A61K39/245;A61K39/215;A61K39/112
• 代理公司: 隆天知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司72003
• 代理人: 付文川,王芝艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基于病毒載體的疫苗，并且更特別地涉及基于血清型8禽腺病毒重組載體的疫苗。

背景技術(shù)

腺病毒是線性、雙鏈、DNA病毒，直徑70-90nm，無包膜，并且具有二十面體形狀的衣殼，所述衣殼由240個六鄰體、12個五鄰體和從每個二十面體頂點延伸的纖維形成。這些六鄰體、五鄰體和纖維代表主要腺病毒抗原，以及決定其血清型的那些。

腺病毒基因組大小約為30-45kb，并且具有四個早期區(qū)(E1、E2、E3和E4)和五個晚期區(qū)(L1-L5)。

腺病毒已分離自不同物種，兩種主要屬是分離自鳥的禽腺病毒屬(Aviadenovirus)和分離自哺乳動物的哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)。

腺病毒視為用于疫苗生產(chǎn)的重組載體的良好候選物，因為它們是高度傳染性的，并且其中許多不是致病性的。另外，腺病毒載體可有效地翻譯大尺寸基因，并在動物中生成延長的免疫應(yīng)答。然而，還已知腺病毒特異性結(jié)構(gòu)需要研究每個物種的異源基因的具體插入位點，并且當(dāng)轉(zhuǎn)換成重組病毒載體時，實際上不可能概括出不同已知腺病毒的生物學(xué)行為。

迄今為止，尤其是人、猿、禽、豬腺病毒已被用作可能用作重組疫苗的載體。特別地，已知禽腺病毒(FadV)是用于制備重組疫苗的潛在候選者。然而，如下所述，由于不能以所需穩(wěn)定性達到其大規(guī)模生產(chǎn)，一般抑制了在商業(yè)水平上，特別是在獸醫(yī)工業(yè)中成功利用它們的可能性，因為腺病毒的生產(chǎn)由細胞系進行，其產(chǎn)量通常非常差，或其性質(zhì)阻止在連續(xù)傳代中獲得病毒載體的穩(wěn)定性，由此很容易理解，現(xiàn)在在禽腺病毒中不存在載體化疫苗。

例如，國際公開號WO94/24268描述了具有插入的至少一個異源核苷酸序列的FAdV重組載體，并且所述FAdV重組載體可用于在對疾病敏感的鳥類中生成免疫應(yīng)答。根據(jù)該文件，可適合于待替換或插入的異源基因的腺病毒基因組的非必需區(qū)是位于基因組右末端處的那些，優(yōu)選位于(97和99.9μ)中的0.0038和0.0039之間的區(qū)域。根據(jù)該文件，重組疫苗顯然可與針對其他病毒的疫苗(例如馬立克氏病或新城疫的那種)組合利用，而無這種的證據(jù)。另外，在該文件中，也未示出在用于大規(guī)模生產(chǎn)的細胞系中的連續(xù)傳代后獲得的腺病毒行為。

此外，美國專利號6,296,852描述了血清型9FAdV載體(FAdV-9)，在其中進行了核苷酸異源序列插入病毒基因組的非必需區(qū)。這些區(qū)域可以是位于基因組左端和/或右端的非編碼區(qū)，優(yōu)選在(60和100μ)中的0.0023和0.0039之間的位于右端(3')上的區(qū)域處。關(guān)于WO94/24268文件，盡管該專利鑒定了用于外源基因的潛在插入的另一個更寬的區(qū)域，但它未示出其在細胞系中連續(xù)傳代之后的行為且特別是其完整性。

在另一個文件中(Corredor,J.C.和Nagy,E.,the non-essential left end region of the fowl adenovirus 9genome is suitable for foreign gene insertion/replacement.Virus Research.第149卷，167-174；2010)，公開了FAdV-9基因組的5'端非必需區(qū)也可以是用于通過外源基因插入或替換以產(chǎn)生重組載體的合適位點。例如，用編碼增強綠色熒光蛋白(EGFP)的基因替換位于491-2782個核苷酸之間的非必需區(qū)，獲得這樣的載體之一。然而，該文件與其他文件一樣，未顯示當(dāng)將編碼疾病抗原的外源基因插入其中，并且通過在合適的細胞系統(tǒng)中復(fù)制它們以獲得重組體疫苗時，所構(gòu)建的病毒載體是否穩(wěn)定，因為該文件僅顯示了報道基因表達并缺乏體內(nèi)測定；此外它沒有提及組成或針對目的疾病的保護水平。

如可見的，已知FAdV基因組的非必需區(qū)代表外源核苷酸序列可被插入或替換的潛在位點。然而，現(xiàn)有技術(shù)中描述的載體具有在以工業(yè)水平生產(chǎn)重組疫苗時不穩(wěn)定的缺點，這是由于在細胞培養(yǎng)物中的不同傳代后插入的異源基因的喪失。

此外，在現(xiàn)有技術(shù)中，已避免了腺病毒載體在鳥類主要是家禽治療中的用途，這是由于其干擾針對馬立克氏病的疫苗，所述疫苗在禽類工業(yè)中廣泛使用。馬立克氏病(EM)是由影響馴養(yǎng)禽類的皰疹病毒引起的狀況，引起引發(fā)腿或翅膀麻痹的淋巴增殖性疾病，和淋巴樣腫瘤以及死亡。為了預(yù)防這種疾病，主要是皮下或卵內(nèi)應(yīng)用單價或多價活性疫苗。